張海晴,張雪迪,劉成永,周冬青,魏素梅,賈 彤, 張禮茂,郭 巖,李 莉,黃海濱

(江蘇省徐州市傳染病醫(yī)院 結(jié)核二科,江蘇 徐州,221004)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染所致，有潛伏期及活動(dòng)期2種疾病狀態(tài)[1-2],潛伏性感染患者早期無(wú)明顯癥狀[3],因此早期發(fā)現(xiàn)和治療潛伏性感染患者對(duì)控制結(jié)核病的傳播意義重大。目前，檢測(cè)結(jié)核潛伏性感染的方法仍不完善，結(jié)核菌素試驗(yàn)不能明確區(qū)分卡介苗接種者、非結(jié)核分枝桿菌感染者、結(jié)核潛伏性感染和活動(dòng)性結(jié)核病者,γ-干擾素 (IFN-γ)釋放試驗(yàn)有局限性，亦不能鑒別潛伏性感染及活動(dòng)性結(jié)核病[4]。因此，尋求結(jié)核潛伏性感染更為有效的診斷方法至關(guān)重要。潛伏性感染及活動(dòng)性結(jié)核病患者中結(jié)核分枝桿菌蛋白表達(dá)差異，可作為潛伏性感染診斷的新思路。本研究通過(guò)同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的休眠株及標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行蛋白質(zhì)組差異表達(dá)篩選，并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行分析，獲得參與潛伏性感染菌株中直接與休眠相關(guān)的能量代謝通路中的蛋白P9WPC9,從而為篩選出可用于結(jié)核潛伏性感染診斷的潛在標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和由標(biāo)準(zhǔn)株誘導(dǎo)的潛伏性感染菌株模型(休眠株)各三皿，分別編號(hào)為sta1、sta2、sta3;dor1、dor2、dor3,數(shù)量為1×107;其中sta3和dor3因樣本蛋白降解，所以未能檢測(cè)出相關(guān)數(shù)據(jù)。試劑為蛋白酶抑制劑(protease inhibitor,美國(guó) Calbiochem公司)、胰酶(trypsinPromega,德國(guó)Merk公司)、乙腈(acetonitrile、超純水，德國(guó) Fisher Chemical公司)、三氟乙酸(trifluoroacetic acid)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol)、三乙基碳酸氫銨(TEAB)、尿素、碘代乙酰胺(iodoacetamide)(三氟乙酸、二硫蘇糖醇、TEAB、尿素、碘代乙酰胺均購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)菌株造模。① 標(biāo)準(zhǔn)菌種培養(yǎng):將結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv接種于提前配置好的中性羅氏培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)上，培養(yǎng)3～4周后將菌株轉(zhuǎn)種于含0.2%甘油、10% ADC的7H9液體培養(yǎng)基(BI)上，并置于搖床中震蕩培養(yǎng)，溫度為37 ℃,160轉(zhuǎn)/min,12～15 h待達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即可(吸光度值約為0.4)。② 休眠菌種模型構(gòu)建:取已經(jīng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行研磨，研磨均勻后，按照菌株與培養(yǎng)基1∶100進(jìn)行配液，加入亞甲藍(lán)，終濃度為1.5 μg/mL。將此混合液制成菌懸液，吸取10 mL于15 mL試管中，上層氣體與下層液體的體積比為1∶2,封口膠密封后置于37 ℃恒溫箱靜止培養(yǎng)。培養(yǎng)12～15 d后，溶液中的亞甲藍(lán)完全處于無(wú)色狀態(tài)時(shí)，說(shuō)明菌株已進(jìn)入完全缺氧休眠狀態(tài)。

(2)iTRAQ技術(shù)。① 菌株樣本蛋白抽提:向不同菌株樣本中分別加入4倍體積(尿素、1%蛋白酶抑制劑)裂解緩沖液，然后進(jìn)行超聲裂解。將裂解后的混合液至于4 ℃離心機(jī)中離心10 min,轉(zhuǎn)速為12 000 g。去除細(xì)胞碎片后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。② 樣品及實(shí)驗(yàn)預(yù)判。③ 蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)還原及巰基封閉后，使用胰蛋白酶進(jìn)行酶切。④ 肽段混合物分別使用4種不同的iTRAQ試劑進(jìn)行標(biāo)記，使用Strata X C18(Phenomenex)將胰酶酶解后肽段進(jìn)行鹽份祛除，待進(jìn)行真空干燥及冷凍處理后，按照0.5 M TEAB將所獲得的肽段全部進(jìn)行溶解處理。根據(jù)iTRAQ操作說(shuō)明書(shū)步驟，將肽段進(jìn)行不同同位素的標(biāo)記，樣本分離信息及相關(guān)標(biāo)記名稱(chēng)見(jiàn)表1。⑤ 等量混合各種iTRAQ試劑標(biāo)記的肽段。⑥ 混合樣品的HPLC分級(jí)處理:選取的色譜柱為Agilent 300 Extend C18,長(zhǎng)度250 mm,內(nèi)徑4.6 mm,粒徑5 μm。在高pH值狀態(tài)下，對(duì)已混合處理好的肽段進(jìn)行反向高效液相色譜法(HPLC)分級(jí)。⑦ 相關(guān)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析:使用EASY-nLC 1200超高效液相系統(tǒng)對(duì)處理好的肽段進(jìn)行分離，所有已處理好的肽段均使用液相色譜流動(dòng)相A進(jìn)行溶解，并將其注入NSI離子源中集中進(jìn)行電離操作，然后進(jìn)入Q Exactive HF-X質(zhì)譜進(jìn)行分析。⑧ 生物信息學(xué)分析:使用Maxquant (v1.5.2.8)對(duì)二級(jí)質(zhì)譜所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索分析，相關(guān)參數(shù)設(shè)置的數(shù)據(jù)庫(kù)為Mycobacterium_tuberculosis_Uniprot (6 529條序列)，數(shù)據(jù)中的假陽(yáng)性率(FDR)可通過(guò)添加反庫(kù)計(jì)算方式進(jìn)行優(yōu)化，在數(shù)據(jù)庫(kù)中添加常見(jiàn)污染庫(kù)，以消除樣本鑒定結(jié)果中污染蛋白的影響,iTRAQ-4plex參數(shù)為1%,蛋白鑒定參數(shù)為1%,PSM鑒定的FDR參數(shù)為1%,相關(guān)參數(shù)設(shè)置見(jiàn)表2。

表1 樣本分離信息及相關(guān)標(biāo)記名稱(chēng)

表2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析相關(guān)參數(shù)設(shè)置

2 結(jié) 果

2.1 蛋白鑒定

iTRAQ定量質(zhì)譜分析共得到365 454張二級(jí)譜圖。蛋白理論數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫(kù)及對(duì)比后共得到可利用有效譜圖數(shù)量為5 624個(gè)，利用率為1.5%。通過(guò)譜圖解析鑒定出518條肽段，其中514條肽段為特異性肽段，共鑒定出238個(gè)蛋白，其中187個(gè)可定量。

2.2 蛋白差異表達(dá)分析

通過(guò)iTRAQ質(zhì)譜定量分析檢測(cè)出肽段對(duì)應(yīng)在每個(gè)樣本中的定量值，每個(gè)蛋白會(huì)對(duì)應(yīng)多個(gè)肽段，計(jì)算蛋白在每個(gè)樣本中的定量值時(shí)，采用蛋白所對(duì)應(yīng)特異性肽段的定量值中值作為該蛋白的定量值。對(duì)于每一次重復(fù)實(shí)驗(yàn),2個(gè)不同樣本之間蛋白定量比值作為差異表達(dá)量(Ratio)。本項(xiàng)目分別進(jìn)行了2次不同重復(fù)實(shí)驗(yàn)，可取2次重復(fù)Ratio值的平均值作為最終Ratio值。同時(shí)，可以取2次不同重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ratio值變異系數(shù)CV值作為最終CV值。當(dāng)CV值<0.1時(shí)，差異表達(dá)量變化超過(guò)1.2作為顯著上調(diào)的變化閾值，小于1/1.2作為顯著下調(diào)的變化閾值。差異表達(dá)蛋白統(tǒng)計(jì)信息見(jiàn)表3。

表3 差異表達(dá)蛋白信息

2.3 基因的本體論(GO)分析

使用GO分析對(duì)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，找出標(biāo)準(zhǔn)株與休眠株中不同差異蛋白在不同信號(hào)通路中的功能，根據(jù)參與條款能量代謝途徑的差異蛋白進(jìn)行分析。差異表達(dá)蛋白在GO二級(jí)分類(lèi)中統(tǒng)計(jì)分布見(jiàn)圖1。

2.4 同源蛋白簇分析(COG/KOG)功能分類(lèi)

將所獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入到數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，找出標(biāo)準(zhǔn)株與休眠株中不同差異蛋白在不同信號(hào)通路中的功能，將差異蛋白進(jìn)行COG/KOG功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)(見(jiàn)圖2)，發(fā)現(xiàn)不同生理狀態(tài)下的結(jié)核桿菌菌株間，差異性表達(dá)的蛋白質(zhì)同樣與能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、蛋白質(zhì)翻譯等關(guān)系。

2.5 差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

對(duì)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和誘導(dǎo)的潛伏性感染菌株樣本中所獲得表達(dá)差異的蛋白進(jìn)行統(tǒng)一編碼，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到STRING(v.10.5)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異蛋白分析，按照參數(shù)confidence score >0.7 (high confidence)提取數(shù)據(jù)，從而分析標(biāo)準(zhǔn)株和潛伏性感染菌株中差異表達(dá)蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)。差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可通過(guò)R package“networkD3”工具構(gòu)建展示，差異表達(dá)蛋白使用圓圈表示，圖中標(biāo)記的紅顏色表示上調(diào)蛋白，藍(lán)顏色表示下調(diào)蛋白。圓圈大小表示2種樣本中差異表達(dá)蛋白及所對(duì)應(yīng)的相互作用蛋白個(gè)數(shù)(圓圈越大說(shuō)明與其互作的蛋白越多，圓圈越小說(shuō)明與其互作的蛋白越少)。圖中編號(hào)為C的部分為能量代謝相關(guān)通路蛋白，可通過(guò)差異蛋白的功能富集分析，清晰找出哪些差異蛋白參與了代謝調(diào)控潛伏性感染菌株能量代謝相關(guān)通路調(diào)節(jié)，從而進(jìn)一步確定關(guān)鍵標(biāo)志物蛋白。取排名前50個(gè)且互作關(guān)系最緊密的蛋白，最終通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比分析繪制出差異表達(dá)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3。

2.6 具有鑒別診斷價(jià)值的蛋白質(zhì)及互作網(wǎng)絡(luò)

蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達(dá)結(jié)果以及生物信息學(xué)分析后得到詳細(xì)蛋白及相關(guān)通路信息，見(jiàn)表4。篩選出的P9WPC9(基因名稱(chēng)為ClpC1)是潛伏期肺結(jié)核具有潛在診斷價(jià)值的蛋白質(zhì)。休眠菌株P(guān)9WPC9表達(dá)水平是標(biāo)準(zhǔn)結(jié)核桿菌菌株的2.2倍，其網(wǎng)絡(luò)互作情況見(jiàn)圖4。

3 討 論

近年來(lái)，雖然醫(yī)療水平已有大幅提高，但結(jié)核病的診斷及治療仍是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[6-7]。耐藥菌株的不斷出現(xiàn)[8]以及糖尿病、免疫缺陷性疾病等合并結(jié)核感染更增加了結(jié)核病的防治難度。傳統(tǒng)結(jié)核菌素試驗(yàn)無(wú)法明確區(qū)分卡介苗接種者、非結(jié)核分枝桿菌感染者、結(jié)核潛伏性感染者及結(jié)核病患者[9];IFN-γ釋放試驗(yàn)亦無(wú)法鑒別結(jié)核潛伏性感染及活動(dòng)性結(jié)核病[10],若患者伴有其他免疫缺陷性疾病[11-12],則可會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此尋求更加準(zhǔn)確、有效的結(jié)核潛伏性感染診斷標(biāo)志物至關(guān)重要。

從蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果中可知，所測(cè)差異蛋白主要與細(xì)胞能量代謝相關(guān)。進(jìn)一步將差異蛋白進(jìn)行COG/KOG功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)不同生理狀態(tài)下結(jié)核桿菌菌株間，休眠株中P9WPC9表達(dá)上調(diào)2.2倍,P9WPC9為ATP依賴(lài)性Clp蛋白酶ATP結(jié)合亞基(基因名稱(chēng)為ClpC1),可以將蛋白酶引導(dǎo)至特定的底物處，亦可在沒(méi)有ClpP的情況下執(zhí)行伴侶功能，在ClpP2存在的情況下降解抗σ-E因子RseA，從而調(diào)節(jié)能量代謝途徑，其調(diào)控主要與能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換、蛋白質(zhì)翻譯等相關(guān)。

因此,P9WPC9有望成為結(jié)核潛伏性感染的潛在診斷性標(biāo)志物。下一步可應(yīng)用western-blot對(duì)P9WPC9蛋白質(zhì)水平進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)等技術(shù)觀(guān)察ClpC1 mRNA水平的改變。研究潛伏性感染及活動(dòng)性結(jié)核病患者P9WPC9表達(dá)的改變，從而進(jìn)一步探討P9WPC9在結(jié)核潛伏性感染診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。