滕 寅,冉 鵬,席 陽,付寧華

(1.貴州醫(yī)科大學,貴州 貴陽,550001;2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 胸外科,貴州 貴陽,550004)

食管癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病機制尚未闡明，且缺乏有效的治療方法[1]。研究[2-4]表明，原癌基因的異常激活及抑癌基因的失活在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，分析腫瘤中異常表達的基因分子及其對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響可為腫瘤的治療提供分子靶點。環(huán)狀RNA(circRNA)和微小RNA(miRNA)是兩類小分子非編碼RNA,其中circRNA可發(fā)揮miRNA分子海綿作用，進而調(diào)控miRNA靶基因的表達，二者在腫瘤的進展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),circ-0005273在乳腺癌[5]、胰腺癌[6]、結腸癌[7]和甲狀腺乳頭狀癌[8]中的表達均顯著上調(diào)，可促進腫瘤的進展，或可作為腫瘤治療的分子靶點。

Circular RNA Interactome靶基因在線軟件預測顯示,circ-0005273可能發(fā)揮miR-1200分子海綿作用。研究[9]發(fā)現(xiàn),miR-1200在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達下調(diào)，通過靶向上調(diào)其表達可阻礙神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑癌基因作用。本研究以食管癌Eca109細胞為研究對象，探討circ-0005273、miR-1200對Eca109細胞增殖和凋亡的影響，分析circ-0005273能否靶向調(diào)控miR-1200而發(fā)揮作用，以明確circ-0005273和miR-1200對食管癌發(fā)生發(fā)展的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月—2019年10月在本院確診并行手術治療的41例食管癌患者的食管癌組織及癌旁組織，其中女8例，男33例，平均年齡(49.25±8.53)歲;TNM分期Ⅰ期3例,Ⅱ期16例,Ⅲ期22例;低分化19例，中分化18例，高分化4例。納入標準:首次確診者;術后病理確診為食管鱗狀細胞癌者。排除標準:合并其他惡性腫瘤者;合并糖尿病、高血壓等慢性疾病者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，患者知情同意。

1.2 細胞和試劑

Eca109細胞系購自中國科學院上海細胞庫;RPMI 1640培養(yǎng)基、細胞計數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京索萊寶;胎牛血清(FBS)購自杭州四季青;PCR引物、circ-0005273小干擾RNA(si-circ-0005273)及亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-1200模擬物(mimcs)及模擬對照序列(miR-NC)、miR-1200抑制劑(anti-miR-1200)及抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、circ-0005273野生型質(zhì)粒(WT-circ-0005273)和突變型質(zhì)粒(MUT-circ-0005273)購自上海生工;RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自大連寶生物;LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司;兔抗人活化的半胱天冬酶9(cleaved-caspase9)、活化的半胱天冬酶3(cleaved-caspase3)抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測組織中circ-0005273和miR-1200表達:將收集的癌組織和癌旁組織在液氮保護下進行研磨，采用RNA抽提試劑盒提取組織中總RNA。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后，行PCR擴增。擴增程序為95 ℃下10 min,95 ℃下10 s,58 ℃下30 s,72 ℃下30 s,共35個循環(huán)。引物序列:circ-0005273上游5′-AATGCCTGTGAACCCATAGTG-3′,下游5′-CTGACAGCATGAGCATCCCT-3′;GAPDH上游5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG -3′,下游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′;miR-1200上游5′-ACACTCCAGCTGGGCTCCTG AGCCATTCTG-3′,下游5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAGGC TCA-3′;U6上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。2-△△Ct法計算circ-0005273相對于GAPDH、miR-1200相對于U6的表達水平。

1.3.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:在超凈工作臺中復蘇Eca109細胞，加含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數(shù)期Eca109細胞接種于6孔板中(5.0×105個/孔)，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，分別轉(zhuǎn)染si-circ-0005273(si-circ-0005273組)、si-NC(si-NC組)、miR-1200 mimcs(miR-1200組)、miR-NC(miR-NC組)、共轉(zhuǎn)染si-circ-0005273與anti-miR-1200(si-circ-0005273+anti-miR-1200組)、si-circ-0005273與anti-miR-NC(si-circ-0005273+anti-miR-NC組)。轉(zhuǎn)染后12 h,更換含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h,收集細胞備用。

1.3.3 CCK-8法檢測細胞增殖:將各組Eca109細胞接種于96孔板中(2.5×104個/孔)，培養(yǎng)24 h,加10 μL CCK-8試劑，孵育2 h,采用酶標儀(λ=450 nm)檢測各孔光密度(OD)值。

1.3.4 克隆形成實驗:將各組Eca109細胞接種于6孔板中(1.0×104個/孔)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)14 d后，棄培養(yǎng)基。采用4 %多聚甲醛固定30 min、0.4 %結晶紫染色20 min后，顯微鏡觀察，對超過50個細胞的克隆進行計數(shù)。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡:將各組Eca109細胞接種于6孔板中(5.0×105個/孔)，培養(yǎng)24 h后收集細胞。采用PBS清洗2次,1 500轉(zhuǎn)/min離心5 min,棄上清。采用Annexin V-FITC/PI試劑盒，上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.6 Western Blot法檢測cleaved-caspase9、cleaved-caspase3蛋白表達:將各組Eca109細胞接種于6孔板中(5.0×105個/孔)，培養(yǎng)24 h后，采用RIPA試劑提取細胞中總蛋白。經(jīng)BCA法定量、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜及5%脫脂奶粉封閉后，分別采用cleaved-caspase9(1∶500)、cleaved-caspase3(1∶500)和β-actin(1∶500)一抗在4 ℃冰箱中進行孵育，過夜后再用山羊抗兔二抗(1∶2 000)在37 ℃搖床中孵育1 h。最后加顯影液避光顯影，曝光拍照,Image J軟件分析cleaved-caspase9、cleaved-caspase3相對于GAPDH的表達量。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?將Eca109細胞接種于6孔板中(5.0×105個/孔)，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ-0005273與miR-1200 mimcs、WT-circ-0005273與miR-NC、MUT-circ-0005273與miR-1200 mimcs、MUT-circ-0005273與miR-NC。轉(zhuǎn)染后12 h,換新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h,收集細胞并裂解,1 500轉(zhuǎn)/min離心5 min,取上清，檢測熒光素酶活性(以螢火蟲熒光強度與海腎熒光強度的比值表示)。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 癌旁組織、食管癌組織中circ-0005273和miR-1200的表達

癌旁組織、食管癌組織中circ-0005273的表達量分別為(1.00±0.06)、(4.21±0.32),miR-1200的表達量分別為(1.00±0.09)、(0.43±0.03)。癌旁組織與食管癌組織中circ-0005273和miR-1200的表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(tcirc-0005273=63.131,P<0.05;tmiR-1200=38.472,P<0.05)。

2.2 干擾circ-0005273表達對食管癌Eca109細胞增殖的影響

結果顯示,si-circ-0005273組Eca109細胞中circ-0005273表達量低于si-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明干擾circ-0005273表達的Eca109細胞構建成功;干擾circ-0005273表達后,Eca109細胞OD值和克隆形成數(shù)也降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明干擾circ-0005273表達抑制食管癌Eca109細胞增殖。見表1。

表1 干擾circ-0005273表達對食管癌Eca109細胞增殖的影響

2.3 干擾circ-0005273表達對食管癌Eca109細胞凋亡的影響

干擾circ-0005273表達后,Eca109細胞凋亡率升高，細胞中凋亡相關蛋白cleavde-caspase9和cleavde-caspase3的表達量增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明干擾circ-0005273表達可促進食管癌Eca109細胞凋亡。見圖1、表2。

表2 干擾circ-0005273表達對食管癌Eca109細胞凋亡的影響

2.4 circ-0005273靶向調(diào)控miR-1200的表達

Circular RNA Interactome靶基因在線軟件預測顯示,circ-0005273與miR-1200的核苷酸序列存在連續(xù)結合位點。共轉(zhuǎn)染miR-1200與WT-circ-0005273的食管癌Eca109細胞熒光素酶活性為(0.53±0.04),低于共轉(zhuǎn)染miR-NC與WT-circ-0005273的細胞熒光素酶活性(1.05±0.08),差異有統(tǒng)計學意義(t=17.441,P<0.05);共轉(zhuǎn)染miR-1200與MUT-circ-0005273的食管癌Eca109細胞熒光素酶活性為(1.01±0.06),與共轉(zhuǎn)染miR-NC與MUT-circ-0005273的細胞熒光素酶活性(1.02±0.07)比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.325,P>0.05),說明circ-0005273可靶向結合miR-1200。同時,si-circ-0005273組食管癌Eca109細胞中miR-1200的表達量為(3.06±0.24),高于si-NC組的(0.97±0.06),差異有統(tǒng)計學意義(t=25.345,P<0.05),說明circ-0005273負調(diào)控miR-1200。見圖2。

2.5 過表達miR-1200對食管癌Eca109細胞增殖和凋亡的影響

結果顯示,miR-1200組Eca109細胞中miR-1200表達量高于miR-NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明過表達miR-1200的Eca109細胞構建成功;過表達miR-1200后,Eca109細胞OD值和克隆形成數(shù)降低，凋亡率及凋亡相關蛋白cleavde-caspase9和cleavde-caspase3的表達量增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明過表達miR-1200阻礙食管癌Eca109細胞增殖，并促進其凋亡。見圖3、表3。

表3 過表達miR-1200對食管癌Eca109細胞增殖和凋亡的影響

2.6 干擾miR-1200逆轉(zhuǎn)了干擾circ-0005273表達對食管癌Eca109細胞增殖和凋亡的作用

與si-circ-0005273+anti-miR-NC組比較,si-circ-0005273+anti-miR-1200組Eca109細胞中miR-1200表達量降低，細胞OD值和克隆形成數(shù)升高，凋亡率及凋亡相關蛋白cleavde-caspase9和cleavde-caspase3的表達量減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明干擾miR-1200可逆轉(zhuǎn)干擾circ-0005273表達對食管癌Eca109細胞增殖的抑制作用及凋亡促進作用。見圖4、表4。

表4 干擾miR-1200逆轉(zhuǎn)干擾circ-0005273對食管癌Eca109細胞增殖和凋亡的作用

3 討 論

食管癌的發(fā)病機制較為復雜，受遺傳、基因和環(huán)境等多種因素的影響[10]。分析食管癌中異常表達的基因分子及其對食管癌發(fā)生發(fā)展的影響和作用機制，可為治療提供分子靶點。研究表明，多種circRNA在食管癌中異常表達，如circ-LRP6[11]、circLPAR3[12]和circRNA_001275[13]等circRNA在食管癌中表達上調(diào)，促進食管癌的進展;而circ_RNA0023397[14]、circLARP4[15]和circ-Foxo3[16]等circRNA在食管癌中表達降低，對食管癌的進展起抑制作用。本研究結果顯示，食管癌組織中circ-0005273的表達量高于癌旁組織，干擾circ-0005273引起食管癌細胞增殖受阻，而凋亡加劇，提示circ-0005273作為致癌基因促進食管癌的進展，其可能成為食管癌治療的分子靶點。

細胞凋亡受多種基因分子和信號通路的影響，其中在線粒體信號通路介導的細胞凋亡過程中，由于線粒體膜電位的降低，導致大量細胞色素C進入細胞質(zhì)，與Apaf-1結合，進而激活caspase級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡[17]。研究[18]顯示,caspase9是caspase級聯(lián)反應的起始分子，其在受到凋亡信號刺激后，被激活生成cleavde-caspase9,進而激活下游效應的caspase3;caspase3被激活后，生成cleavde-caspase3,進而剪切細胞內(nèi)各種底物，誘導細胞凋亡。本研究顯示，干擾circ-0005273表達增加了食管癌細胞中cleavde-caspase9和cleavde-caspase3蛋白的表達量，提示circ-0005273可能通過調(diào)控caspase級聯(lián)反應來影響食管癌細胞凋亡。

研究[19]顯示circRNA可與miRNA競爭性結合，調(diào)控miRNA靶基因的表達，進而發(fā)揮生物學調(diào)控作用。為了進一步探究circ-0005273參與調(diào)控食管癌細胞增殖和凋亡的分子機制，本研究證實了circ-0005273靶向結合并負向調(diào)控miR-1200,這與本研究中食管癌組織中circ-0005273表達升高而miR-1200表達降低的結果一致。研究[20]顯示,circ_0001785在骨肉瘤細胞系中高表達，敲減circ_0001785可減弱骨肉瘤細胞的增殖能力，并誘導骨肉瘤細胞凋亡，其作用機制與競爭性結合miR-1200并正向調(diào)控HOXB2的表達有關，為闡明骨肉瘤發(fā)病機制提供了新的思路;circ_0026359在胃癌中表達升高，其通過靶向抑制miR-1200并促進POLD4的表達增強胃癌細胞的順鉑抗性,circ_0026359/miR-1200/POLD4軸可能為逆轉(zhuǎn)胃癌細胞順鉑抗性提供了分子靶點[21]。本研究顯示，過表達miR-1200對食管癌細胞增殖起抑制作用，而對其凋亡發(fā)揮促進作用，且干擾miR-1200逆轉(zhuǎn)了干擾circ-0005273對食管癌細胞增殖和凋亡的影響，進而提示circ-0005273通過靶向負調(diào)控miR-1200來影響食管癌細胞的增殖和凋亡，進而促進食管癌的發(fā)展進程。

本研究也存在不足之處:miR-1200靶基因及下游信號通路對食管癌發(fā)生發(fā)展的影響還未進行研究，且未在體內(nèi)驗證circ-0005273/miR-1200軸對食管癌發(fā)生發(fā)展的影響，這將是后續(xù)研究的重點。

綜上所述，食管癌組織中circ-0005273表達升高，而miR-1200表達降低;干擾circ-0005273可有效阻礙食管癌細胞的增殖能力，并誘導食管癌細胞凋亡，其作用機制可能與靶向負調(diào)控miR-1200有關,circ-0005273/miR-1200軸可能為食管癌發(fā)病機制的闡明及治療靶點的選擇提供了新途徑。