劉培發(fā),侯文宇,菅雁兵

(中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心,北京,100853)

乳腺癌是乳腺上皮細(xì)胞發(fā)生惡變的嚴(yán)重疾病，其早期癥狀以乳房腫塊、乳頭溢液等為主，經(jīng)手術(shù)治療后預(yù)后相對較好，但由于對早期癥狀不夠重視，隨疾病進(jìn)展，癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移可致全身多器官病變，此時治療難度大且患者遠(yuǎn)期存活的概率明顯降低。研究[1]發(fā)現(xiàn)乳腺癌病情進(jìn)展是多因素參與的復(fù)雜過程，相關(guān)基因及蛋白的異常表達(dá)在其發(fā)展過程中起重要作用。研究顯示[2]多種微小核糖核酸(miRNAs)在乳腺癌組織中異常表達(dá)，參與癌變及患者預(yù)后情況。微小核糖核酸-485-3p(miR-485-3p)可在一定程度上調(diào)控乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性[3]。Xklp2靶蛋白(TPX2)是一種參與細(xì)胞紡錘體合成的微管調(diào)節(jié)蛋白，其過表達(dá)與三陰性乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)[4]。已有研究[5]證實(shí),miR-485-3p可通過靶向TPX2抑制大腸癌的發(fā)展。但miR-485-3p是否可通過靶向TPX2參與乳腺癌的惡變過程仍不清楚。因此，本研究通過檢測乳腺癌組織miR-485-3p、TPX2表達(dá)，探討二者在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年1月—2016年1月在本院就診并行手術(shù)切除的乳腺癌患者105例為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):① 均符合乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)[6]者;② 術(shù)前未接受抗腫瘤治療者;③ 術(shù)中留取的乳腺癌組織及距癌組織5 cm以上的配對癌旁正常組織可用者;④均簽署手術(shù)同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn):① 肝腎功能不全者;② 有其他惡性腫瘤者;③ 有血液疾病者;④ 臨床資料不完整者。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

患者年齡30～65歲，平均年齡(48.07±12.39)歲;腫瘤直徑<2 cm者47例，≥2 cm者58例;TNM分期包括Ⅰ期25例，Ⅱ期46例，Ⅲ期34例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例;孕激素受體(PR)表達(dá):陰性53例，陽性52例;雌激素受體(ER)表達(dá):陰性76例，陽性29例;人表皮生長因子受體-2(HER-2)表達(dá):陰性57例，陽性48例;Ki-67表達(dá):陰性44例，陽性61例。

1.2 方法

1.2.1 TPX2蛋白表達(dá)檢測:術(shù)中留取的乳腺癌組織及癌旁正常組織固定(10%中性福爾馬林)后，使用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行染色，具體步驟參照SP試劑盒(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)說明書進(jìn)行。小鼠抗人TPX2單克隆抗體(購自上?，庬嵣锟萍加邢薰?稀釋濃度為1∶500,陰性和陽性對照分別為磷酸鹽緩沖液、已知陽性切片。結(jié)果判定:TPX2蛋白陽性主要定位于細(xì)胞核，顯微鏡下觀察呈棕黃色顆粒。每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)10個高倍視野(放大200倍)，觀察陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算所占百分比。TPX2蛋白陽性:染色細(xì)胞比例≥10%;TPX2蛋白陰性:染色細(xì)胞比例<10%。

1.2.2 miR-485-3p、TPX2 mRNA表達(dá)水平檢測:采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測組織中miR-485-3p、TPX2 mRNA的表達(dá)。首先提取組織中總RNA，提取方法參照深圳子科生物科技有限公司生產(chǎn)的Trizol試劑盒說明，然后使用酶標(biāo)儀測定其濃度和純度，合格后將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-485-3p正向引物為5′-CCCGATAAAGCTAGATAACC-3′,反向引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;內(nèi)參U6正向引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCAC-3′,反向引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。TPX2 mRNA正向引物為5′-TTTGGTATCAGACCCGAAGC-3′,反向引物為5′-TCCCCATGTTTGTCAGTGAA-3′;內(nèi)參GAPDH正向引物為5′-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′,反向引物為5′-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3′。反應(yīng)條件為:95 ℃下10 min,95 ℃下15 s,60 ℃下1 min,72 ℃下10 s,以此程序反應(yīng)45個循環(huán)。保存數(shù)據(jù)Ct值，并利用公式2??-Ct計(jì)算miR-485-3p、TPX2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn):通過ENCORI數(shù)據(jù)庫確定miR-485-3p和TPX2的結(jié)合位點(diǎn)，將TPX2的3′UTR序列插入pGL3熒光素酶報告載體的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建野生型和突變型的表達(dá)載體，選取人上皮HEK293T細(xì)胞5×105個(均處于對數(shù)生長期)，根據(jù)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)說明書將miR-485-3p過表達(dá)模擬物(miR-485-3p mimics)、miRNA 陰性對照(miR-NC)分別和野生型、突變型表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h制備裂解物，并用雙熒光素酶試劑盒(北京奧秘佳得醫(yī)藥科技有限公司)染色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Promega GloMaxTM20/20發(fā)光檢測儀(上海劍凌信息科技有限公司)檢測熒光素酶相對活性。

1.2.4 隨訪:患者出院后，采用打電話及門診復(fù)查的方式隨訪5年，隨訪終點(diǎn)為患者死亡或隨訪結(jié)束(2021年1月31日)。統(tǒng)計(jì)患者生存時間，計(jì)算5年總生存率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織和癌旁正常組織中TPX2蛋白表達(dá)情況

乳腺癌組織中TPX2蛋白陽性率為76.19%,高于癌旁正常組織的37.14%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 乳腺癌組織和癌旁正常組織中TPX2蛋白表達(dá)情況

A:癌旁正常組織陰性;B:乳腺癌組織陽性。

2.2 乳腺癌組織和癌旁正常組織中miR-485-3p、TPX2 mRNA表達(dá)水平比較

乳腺癌組織中miR-485-3p表達(dá)水平低于癌旁正常組織,TPX2 mRNA表達(dá)水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 乳腺癌組織和癌旁正常組織中miR-485-3p、

2.3 乳腺癌組織中miR-485-3p、TPX2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

以miR-485-3p均值進(jìn)行分組，分為miR-485-3p低表達(dá)(<均值者)和miR-485-3p高表達(dá)(≥均值者)。乳腺癌組織中miR-485-3p、TPX2蛋白表達(dá)與患者年齡、腫瘤直徑及PR、ER、HER-2表達(dá)無關(guān)(P>0.05),與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67表達(dá)有關(guān)(P<0.05)。見表3。

2.4 miR-485-3p與TPX2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析

經(jīng)ENCORI數(shù)據(jù)庫預(yù)測,miR-485-3p在TPX2的3′UTR存在相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，見圖2;雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pGL3-TPX2+miR-NC相比,pGL3-TPX2-野生型+miR-485-3p mimics的熒光素酶相對活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而pGL3-TPX2-突變型+miR-485-3p mimics和pGL3-TPX2-突變型+miR-NC的熒光素酶相對活性相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖3;Pearson檢驗(yàn)分析顯示，乳腺癌組織中miR-485-3p表達(dá)與TPX2 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.507,P<0.05),見圖4。

表3 乳腺癌組織中miR-485-3p、TPX2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.5 乳腺癌組織中miR-485-3p、TPX2蛋白表達(dá)與患者總生存率的關(guān)系

乳腺癌患者5年總生存率為65.71%(69/105)。miR-485-3p高表達(dá)者、低表達(dá)者5年總生存率分別為77.78%、52.94%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.181,P=0.007);TPX2蛋白陰性者、陽性者5年總生存率分別為84.00%、60.00%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.870,P=0.027)。見圖5。

圖5 乳腺癌組織中miR-485-3p、TPX2蛋白表達(dá)與患者總生存率的關(guān)系

2.6 影響乳腺癌患者總生存的危險因素

COX回歸分析顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-485-3p低表達(dá)、TPX2蛋白陽性是影響乳腺癌患者總生存的獨(dú)立危險因素(P<0.05)。見表4。

3 討 論

miRNAs是一類高度保守的小RNA,可通過與相關(guān)靶基因結(jié)合在乳腺癌惡變過程中發(fā)揮作用。WANG Y W等[7]研究報道,miR-4732-5p參與乳腺癌發(fā)生，且可通過靶向四跨膜蛋白13促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。許發(fā)功等[8]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中miR-144-3p低表達(dá)，其低表達(dá)與患者預(yù)后不良有一定關(guān)聯(lián)。因此，探討乳腺癌組織中miRNAs表達(dá)水平，對乳腺癌的靶向治療及改善患者近、遠(yuǎn)期預(yù)后有一定臨床意義。

miR-485-3p是近年來較重視的一種miRNAs,具有抑制腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移的能力，在腫瘤耐藥及預(yù)后中均具有重要作用[9]。WANG M等[10]研究發(fā)現(xiàn),miR-485-5p可通過靶向生存素在乳腺癌進(jìn)展及化療敏感性中發(fā)揮抑制作用。WANG X等[11]研究報道，乳腺癌組織中miR-485-5p低表達(dá)，能與黏蛋白1的3′-非編碼區(qū)結(jié)合抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移。目前,miR-485-5p在乳腺癌中的作用較明確，但miR-485-3p與乳腺癌發(fā)生及患者預(yù)后的關(guān)系尚不十分明確。本研究采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測miR-485-3p的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中miR-485-3p表達(dá)水平較癌旁正常組織低;以miR-485-3p均值分為miR-485-3p低表達(dá)和高表達(dá)，結(jié)果顯示，其與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67表達(dá)有關(guān)，提示miR-485-3p表達(dá)可能參與乳腺癌的發(fā)生及病情進(jìn)展。本研究繪制以miR-485-3p均值分組的Kaplan-Meier生存曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-485-3p低表達(dá)者5年總生存率相對較低，且COX回歸結(jié)果顯示miR-485-3p低表達(dá)與乳腺癌患者總生存獨(dú)立相關(guān)，提示檢測乳腺癌組織中miR-485-3p表達(dá)，可能對評估乳腺癌患者遠(yuǎn)期預(yù)后有所幫助。

表4 影響乳腺癌患者總生存的危險因素

TPX2定位于人染色體20q11.2,結(jié)構(gòu)高度保守，具有維持細(xì)胞紡錘體穩(wěn)定的作用[12]。近年來，相關(guān)研究[14-15]發(fā)現(xiàn),TPX2具有癌基因的特性，其高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的臨床分期、復(fù)發(fā)及患者生存情況密切相關(guān)。一項(xiàng)研究[16]表明,TPX2在乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲中發(fā)揮一定作用。但TPX2異常表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系尚有待驗(yàn)證。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中TPX2蛋白陽性率、TPX2 mRNA表達(dá)水平均較癌旁正常組織高，同時發(fā)現(xiàn)TPX2蛋白表達(dá)與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ki-67表達(dá)有關(guān)，提示TPX2表達(dá)可能在乳腺癌發(fā)病及病情進(jìn)展中發(fā)揮作用。Kaplan-Meier生存曲線顯示,TPX2蛋白陰性者5年總生存率明顯高于陽性者，且COX回歸分析發(fā)現(xiàn)TPX2蛋白陽性是影響乳腺癌患者總生存的獨(dú)立危險因素，提示TPX2蛋白可能是判斷乳腺癌患者遠(yuǎn)期生存情況的生物學(xué)指標(biāo)之一。此外,ENCORI數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-485-3p與TPX2存在靶向關(guān)系，且經(jīng)雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中miR-485-3p表達(dá)與TPX2 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示miR-485-3p可能通過負(fù)調(diào)控TPX2參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，但其具體作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，乳腺癌組織中miR-485-3p低表達(dá)、TPX2高表達(dá)以及二者異常表達(dá)均與患者5年總生存率有關(guān)，其有望成為潛在干預(yù)乳腺癌治療策略的靶基因。但miR-485-3p與TPX2的調(diào)控關(guān)系并未從分子機(jī)制上進(jìn)行探討，今后需深入分析。