張化明 張 華 魏 恒

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，即使采用手術(shù)聯(lián)合術(shù)后放/化療等綜合治療，效果仍不理想?；蛑委熡型蔀槟z質(zhì)瘤的治療方法之一，但目前仍缺乏理想可靠的治療靶標(biāo)。谷氨酸受體亞基1（glutamate ionotropic receptor type subunit 1，GRIN1）是離子型谷氨酸受體中的一類亞基，兩個GRIN1亞基和兩個GRIN2亞基組成的N-甲基-D-天冬氨酸受體在谷氨酸系統(tǒng)中起著重要的作用[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)GRIN1 的表達(dá)異常與多種惡性腫瘤（如肺癌、乳腺癌、喉癌、胃癌）的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[2～4]。本文探討GRIN1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)分析 計(jì)算機(jī)檢索CGGA 數(shù)據(jù)庫（http://www.cgga.org.cn/index.jsp）、GEPIA 數(shù) 據(jù) 庫（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html），下載腦膠質(zhì)瘤基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)和對應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。CGGA 數(shù)據(jù)庫下載321 例腦膠質(zhì)瘤樣本數(shù)據(jù)，GEPIA 數(shù)據(jù)庫下載163 例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）、518 例低級別膠質(zhì)瘤（low-grade glioma，LGG）、207 例正常腦組織樣本數(shù)據(jù)。采用生信分析方法分析不同組織GRIN1表達(dá)變化及其與膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的關(guān)系。

1.2 膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本的采集 收集2017 年1 月至2020 年12 月手術(shù)切除腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本67 例，其中男38 例，女29 例；年齡48～73 歲。WHO 分級Ⅱ級23例，其中男13 例，女10 例；平均年齡（59.32±9.25）歲。WHO分級Ⅲ級18例，其中男10例，女8例；平均年齡（58.48±8.43）歲。WHO 分級Ⅳ級26 例，其中男15例，女11例；年齡（57.48±8.78）歲。另收集顱腦損傷內(nèi)減壓術(shù)切除的非腫瘤腦組織標(biāo)本10 例作為對照，其中男6 例，女4 例；平均年齡（60.23±9.57）歲。

1.3 免疫組化染色檢測GRIN1 的表達(dá) 常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片。經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化、洗脫二甲苯，再用3%過氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶，隨后用山羊血清封閉。滴加兔抗人GRIN1 單克隆抗體（1:200；美國Abcam 公司），4 ℃搖床孵育12 h，室溫孵育30 min，PBS 洗滌5 min×3 次；加稀釋的二抗（1:100；美國Beyotime 公司）37 ℃孵育1 h，PBS 洗滌5 min×3 次；DAB 顯色，顯微鏡下觀察顯色效果，自來水終止顯色，蘇木素染液襯染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。顯微鏡下每張切片觀察5 個視野，每個高倍鏡至少觀察100 個細(xì)胞（圖1）。參考文獻(xiàn)[5]報(bào)道方法采用染色細(xì)胞百分比結(jié)合染色程度判讀，兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法觀察。染色程度評分（以陰性著色、淡黃色、黃色、深黃色分別計(jì)0、1、2、3 分）、染色細(xì)胞百分比評分（1%～25%為1分；26%～50%為2分；＞50%為3分）。最終將分?jǐn)?shù)相乘，得出GRIN1 表達(dá)評分，0～3 分為低表達(dá)，4～9分為高表達(dá)。

圖1 膠質(zhì)瘤GRIN1表達(dá)水平的生信分析

圖1 免疫組化染色檢測GRIN1的表達(dá)

1.4 術(shù)后隨訪 隨訪截止2021年8月1日或者病人死亡，包括門診、電話隨訪等，記錄生存、死亡情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行分析；計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；采用多因素Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析死亡的危險(xiǎn)因素；采用Kaplan-Meier 曲線分析GRIN1 表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病人生存期的關(guān)系；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生信分析結(jié)果 與正常腦組織相比，GBM和LGG組織GRIN1 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.001，圖2A）；而且，GRIN1 表達(dá)水平隨膠質(zhì)瘤病理級別增高而明顯降低（P＜0.001，圖2B）。GRIN1高表達(dá)組膠質(zhì)瘤病人中位生存期較低表達(dá)組明顯縮短（P＜0.0001，圖3）。2.2 67例膠質(zhì)瘤分析結(jié)果 非腫瘤腦組織、Ⅱ級膠質(zhì)瘤、Ⅲ級膠質(zhì)瘤、Ⅳ級膠質(zhì)瘤GRIN1低表達(dá)率分別為0%、21.7%（5/23）、72.2%（13/18）、73.1%（19/26），隨膠質(zhì)瘤病理級別增高，GRIN1表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。單因素分析結(jié)果顯示，WHO分級、腫瘤直徑、腫瘤切除程度、GRIN1 表達(dá)水平與病人生存預(yù)后有關(guān)（P＜0.05，表1）。多因素Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果顯示，腫瘤未全切除、GRIN1低表達(dá)是腦膠質(zhì)瘤生存預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05，表2）。生存曲線分析顯示，GRIN1 低表達(dá)組膠質(zhì)瘤病人中位生存期較高表達(dá)組明顯縮短（P＜0.05，圖3）。

表1 本文67例膠質(zhì)瘤預(yù)后影響因素的單因素分析

表2 本文67例膠質(zhì)瘤預(yù)后影響因素的多因素Cox回歸分析

圖2 GRIN1表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的關(guān)系

圖3 生存曲線分析GRIN1 表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病人生存預(yù)后的關(guān)系

3 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，特別是GBM，惡性程度高，預(yù)后差。膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及多個基因的異常表達(dá)，因此，分析膠質(zhì)瘤發(fā)生和預(yù)后的影響因素具有重要的臨床意義。本文發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤GRIN1呈低表達(dá)，增加膠質(zhì)瘤病人死亡的風(fēng)險(xiǎn)。

GRIN1 是N-甲基-D-天冬氨酸受體的一類亞基。N-甲基-D-天冬氨酸受體由兩個GRIN1亞基與兩個GRIN2 亞基共同組成。GRIN1 是所有功能性N-甲基-D-天冬氨酸受體的必需亞基，在神經(jīng)元中廣泛表達(dá)[6]。GRIN1 可以通過調(diào)控配體門控離子通道（例如鉀、鈉和鈣離子的交換），調(diào)控N-甲基-D-天冬氨酸受體通道，在神經(jīng)元發(fā)育、生存等過程中起重要的作用。GRIN1 亞基最重要的作用是降低N-甲基-D-天冬氨酸受體激動劑的效力，防止N-甲基-D-天冬氨酸受體通道的過度激活[7，8]。因此，當(dāng)GRIN1 表達(dá)降低時，N-甲基-D-天冬氨酸受體功能過度激活，可通過一系列下游通道的激活，引起相應(yīng)的生理病理變化。同時，GRIN1 可以和GRIN2 競爭激動劑或拮抗劑的結(jié)合位點(diǎn)，影響N-甲基-D-天冬氨酸受體的功能[9]。

鈣調(diào)蛋白、鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶可與包括GRIN1 在內(nèi)的多種谷氨酸受體相互作用，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞向膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，提示GRIN1 參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程[10]。N-甲基-D-天冬氨酸受體的激活可增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，減輕氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)谷氨酸代謝[11]。N-甲基-D-天冬氨酸受體的激活不僅有助于神經(jīng)膠質(zhì)增殖和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生[12]，而且還調(diào)節(jié)其侵襲和分化能力[13]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的快速增加和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的加快，激活N-甲基-D-天冬氨酸受體，促進(jìn)細(xì)胞分裂、分化和細(xì)胞內(nèi)修飾[14]。此外，研究表明細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加激活N-甲基-D-天冬氨酸受體后可以通過激活絲氨酸/蘇氨酸激酶通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲[15]，還可以激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶通路[16]和蛋白激酶A通路[17]，促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤GRIN1呈低表達(dá)，與病人的不良預(yù)后相關(guān)，可作為膠質(zhì)瘤預(yù)后的預(yù)測因子。