于 淼，郭蓉娟，劉 欣，李秀珍，趙超群，李青穆，陳 夢(mèng)，孟 園，袁 晶，李賽賽

高血壓是心腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且持續(xù)性的高血壓能夠引發(fā)心、腦、腎等靶器官的損傷甚至衰竭。因此，高血壓的產(chǎn)生機(jī)制及其防治一直是心血管領(lǐng)域研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)。高血壓的發(fā)病機(jī)制主要有：遺傳、交感神經(jīng)系統(tǒng)[如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)]激活、內(nèi)皮功能紊亂、毛細(xì)血管血流受損及炎癥介質(zhì)介導(dǎo)等學(xué)說(shuō)[1-2]。其中內(nèi)皮功能紊亂較復(fù)雜，主要由于內(nèi)皮源性舒張因子(EDRFs)與內(nèi)皮源性收縮因子(EDCFs)二者平衡失調(diào)所致[3]。其中，舒張因子一氧化氮(NO)與收縮因子內(nèi)皮素-1(ET-1)常作為內(nèi)皮功能的檢測(cè)指標(biāo)。

雌激素能夠降低血壓，且對(duì)內(nèi)皮功能有保護(hù)作用[4-8]。雌激素替代療法中，雌激素被用作女性圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后高血壓的臨床治療藥物，但尚存在一定爭(zhēng)議。中醫(yī)對(duì)于衰老性疾病的治療有其優(yōu)勢(shì)，二仙湯(主要組分為仙茅、仙靈脾，又稱淫羊藿)治療女性圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后高血壓臨床療效明顯。淫羊藿苷作為淫羊藿的有效成分，屬于異戊烯類黃酮類化合物，結(jié)構(gòu)與雌激素類似，屬于植物類雌激素，通過(guò)抑制心室重構(gòu)、減少心肌肥厚等機(jī)制產(chǎn)生降壓作用[9-10]。本研究觀察淫羊藿苷對(duì)去勢(shì)雌性大鼠血壓、心率及血清NO、ET-1水平的影響，探討淫羊藿苷的降壓機(jī)制及其類雌激素作用，為植物類雌激素及中醫(yī)補(bǔ)腎法治療臨床心血管疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 9周齡清潔級(jí)雌性自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)36只，體質(zhì)量(150±10)g。9周齡清潔級(jí)具有相同遺傳背景的正常血壓雌性京都Wistar大鼠(空白組)6只，體質(zhì)量(150±10)g，以上動(dòng)物均購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證編號(hào)：SCXK(京)2016-0006]。普通飼料喂養(yǎng)，室溫(22±2)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，光照時(shí)間07：00～19：00。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂(lè))，德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：200A5；雌激素受體拮抗劑，氟維司群注射液(芙仕得)，國(guó)藥集團(tuán)醫(yī)藥控股北京華鴻有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：LK774；淫羊藿苷，98%純度標(biāo)準(zhǔn)品，南京廣潤(rùn)生物制品有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：GR-133-150509。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 大鼠尾套管法無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)(日本Softron公司生產(chǎn)，型號(hào)：BP-2006A)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)，型號(hào)：B004)。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 一氧化氮酶法(比色法)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：A012-1-2)，ET-1酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：H093)，磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)兔來(lái)源單克隆抗體(美國(guó)CST公司，貨號(hào)：4060S)，蛋白激酶B(Akt)兔來(lái)源單克隆抗體(美國(guó)CST公司，貨號(hào)：4685S)。

1.5 實(shí)驗(yàn)造模 6只京都Wistar雌性大鼠、36只雌性SHR給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，繼而行無(wú)菌卵巢切除術(shù)。1 mL/100 g 4%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹位固定，于軀干下1/3、脊柱兩側(cè)各1 cm處沿脊柱方向作縱形切口，長(zhǎng)約1 cm，逐層分離，深入體腔，可見肉色卵巢團(tuán)塊，用眼科鑷輕輕將其拉出，下方連接直徑約0.1 cm的肉色輸卵管，在輸卵管近卵巢端穿一絲線，結(jié)扎，剪去卵巢及余線，將組織回納入腹腔，縫合切口，給予切口青鏈霉素預(yù)防感染。

1.6 實(shí)驗(yàn)分組 術(shù)后14 d，6只京都Wistar去勢(shì)雌性大鼠作為空白組，36只去勢(shì)雌性SHR大鼠隨機(jī)分為模型組、雌激素組、淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組、淫羊藿苷高劑量組及淫羊藿苷中劑量+氟維司群組，每組6只。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明淫羊藿苷中劑量組每天20 mg/kg保護(hù)效應(yīng)最明顯，因此，設(shè)置淫羊藿苷中劑量組+雌激素受體拮抗劑。空白組、模型組給予溶劑純水灌胃，雌激素組開始給予戊酸雌二醇(每天0.1 mg/kg)灌胃，淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組、淫羊藿苷高劑量組分別給予每天10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的淫羊藿苷灌胃，淫羊藿苷中劑量+氟維司群組除給予淫羊藿苷每天20 mg/kg，皮下注射氟維司群注射液，每月52 mg/kg。

1.7 標(biāo)本采集 ①血樣標(biāo)本采集：于給藥8周后，用7%水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠腹主動(dòng)脈取血，放入紅色促凝采血管，3 000 r/min離心15 min分離血清，檢測(cè)血清NO及ET-1水平。②蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)標(biāo)本，剝離整根主動(dòng)脈放入液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，檢測(cè)p-Akt蛋白及Akt總蛋白表達(dá)。

1.8 檢測(cè)指標(biāo)

1.8.1 血壓及心率 藥物干預(yù)8周后測(cè)量各組大鼠平均動(dòng)脈壓(MAP)及心率。測(cè)量方法：用動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓計(jì)BP-2006A，將套管套在大鼠尾部，加熱鼠籠，使大鼠在溫暖的環(huán)境中逐漸平靜，待情緒穩(wěn)定后測(cè)量大鼠靜息狀態(tài)下的血壓及心率。

1.8.2 血清NO及ET-1水平檢測(cè) 硝酸還原酶法檢測(cè)各組大鼠血清NO水平，ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清ET-1水平，操作按試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行。

1.8.3 主動(dòng)脈Akt通路相關(guān)蛋白含量檢測(cè) 截取主動(dòng)脈，用于主動(dòng)脈p-Akt蛋白及Akt總蛋白表達(dá)的Western Blot檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 各組MAP、心率比較 與空白組比較，模型組MAP明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，雌激素組、淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組及淫羊藿苷高劑量組MAP明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與淫羊藿苷中劑量組比較，淫羊藿苷中劑量+氟維司群組MAP明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組心率與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組及淫羊藿苷高劑量組心率明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與淫羊藿苷中劑量組比較，淫羊藿苷中劑量+氟維司群組心率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表1。

表1 各組MAP、心率比較 ()

2.2 各組血清NO、ET-1水平比較 與空白組比較，模型組血清NO水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，雌激素組、淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組及淫羊藿苷高劑量組血清NO水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與雌激素組比較，淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組NO水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與淫羊藿苷中劑量組比較，淫羊藿苷中劑量+氟維司群組NO水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組血清ET-1水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，雌激素組、淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組及淫羊藿苷高劑量組血清ET-1水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與淫羊藿苷中劑量組比較，淫羊藿苷中劑量+氟維司群組ET-1水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組血清NO、ET-1水平比較 ()

2.3 各組p-Akt/Akt相對(duì)表達(dá)量比較 與空白組比較，模型組p-Akt/Akt相對(duì)表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，雌激素組、淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組及淫羊藿苷高劑量組p-Akt/Akt相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與淫羊藿苷中劑量組比較，淫羊藿苷中劑量+氟維司群組p-Akt/Akt相對(duì)表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組p-Akt/Akt相對(duì)表達(dá)量比較 ()

3 討 論

本研究給予大鼠卵巢切除術(shù)，模擬圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后期低雌激素水平狀態(tài)。與具有相同遺傳背景的空白組比較，雌性SHR血壓明顯升高。既往研究證實(shí)，淫羊藿苷能通過(guò)改善腎損傷、減少心室重構(gòu)及心肌細(xì)胞凋亡，從而改善高血壓靶器官損害，但尚缺乏淫羊藿苷對(duì)血壓作用的報(bào)道[9，11-12]。本研究表明，淫羊藿苷能降低去勢(shì)雌性SHR血壓，該作用與雌激素類似，且能夠被雌激素受體拮抗劑阻斷。

既往研究表明，京都Wistar雌性大鼠心率比雌性SHR快[13]。但本研究發(fā)現(xiàn)，去勢(shì)雌性京都Wistar大鼠與去勢(shì)雌性SHR心率無(wú)明顯差異。因此，雌激素水平的高低是否是導(dǎo)致這一差異的原因，尚需進(jìn)一步研究。關(guān)于雌激素對(duì)SHR心率影響的國(guó)內(nèi)外研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)：外源性雌激素補(bǔ)充能降低雌性SHR的血壓，且淫羊藿苷與雌激素在對(duì)心率的影響方面相似，淫羊藿的該作用能被雌激素受體拮抗劑削弱。

NO是一種內(nèi)皮源性舒張因子，具有較強(qiáng)的舒張血管的作用，其作用機(jī)制為NO激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)，后者將三磷酸鳥苷(GTP)轉(zhuǎn)化為環(huán)磷鳥苷(cGMP)，從而激活蛋白激酶G導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣濃度下降；另一方面，NO 能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣三磷酸腺苷(ATP)酶，從而降低細(xì)胞內(nèi)鈣濃度。此外，NO還能夠降低炎性因子及組織因子的釋放、抑制血管細(xì)胞增殖、減少血小板黏附。ET-1是迄今所知縮血管最強(qiáng)的物質(zhì)，主要通過(guò)與血管平滑肌細(xì)胞上ET-A型受體結(jié)合，激活L-型鈣通道，使Ca2+內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，與肌鈣蛋白結(jié)合引起收縮。ET-1還能影響炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)、胚胎發(fā)育、腎功能、心血管穩(wěn)態(tài)、內(nèi)分泌功能、呼吸功能、生殖系統(tǒng)等。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是NO及ET-1共同的上游信號(hào)途徑，也是雌激素膜受體的下游信號(hào)通路[14]。既往研究表明，與京都Wistar大鼠比較，SHR血清NO水平明顯降低，而ET-1水平明顯升高；雌激素能夠通過(guò)下調(diào)PI3K/Akt通路蛋白表達(dá)，升高血清 NO，降低血清ET-1水平，起到對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用[15-19]。本研究表明，淫羊藿苷與雌激素相似，能夠升高血清NO水平而降低ET-1水平，從而調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能，該作用是通過(guò)下調(diào)Akt蛋白磷酸化表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，且可被雌激素受體拮抗劑所阻斷。因此，淫羊藿苷的降血壓作用與其調(diào)節(jié)NO及ET-1的分泌量及功能有關(guān)。

綜上所述，淫羊藿苷作為植物類雌激素，能夠通過(guò)改善內(nèi)皮功能而發(fā)揮降壓作用。其作用溫和，具有臨床藥用價(jià)值。本研究為二仙湯及補(bǔ)腎法在圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性高血壓的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)，也為植物類雌激素在圍絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性心血管疾病的臨床預(yù)防及治療應(yīng)用方面提供了理論基礎(chǔ)。