郭施勉，楚英杰

冠心病是指由冠狀動脈血管發(fā)生粥樣硬化引起的血管狹窄、阻塞，從而造成心肌缺血、缺氧甚至壞死的心臟疾病，是臨床上常見的心血管疾病[1]。冠心病主要高發(fā)于中老年或合并心血管基礎疾病的病人，隨著社會人口老齡化的加快以及生活習慣的改變，冠心病發(fā)病率逐年增加，由冠心病導致的猝死也時有發(fā)生，嚴重威脅人們的生命健康和安全[2]。人參皂苷Rg1是從人參中提取的一種中藥活性物質，研究表明，人參皂苷Rg1在中樞神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及抗腫瘤方面均發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[3]。近代藥理研究證明，人參皂苷對缺血性心臟病、心律失常、心力衰竭以及心肌缺血再灌注損傷等多種心血管系統(tǒng)疾病具有深遠的臨床意義，但關于人參皂苷Rg1在心血管系統(tǒng)中的作用仍鮮有報道[4]。研究發(fā)現，人參皂苷Rg1對神經細胞內質網的應激反應具有一定的抑制作用，可抑制神經細胞凋亡[5]。本研究擬通過構建大鼠冠心病模型，在體內外實驗中觀察人參皂苷Rg1對心肌細胞凋亡的作用，為人參皂苷Rg1在冠心病中的作用研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級健康雄性SD大鼠50只，體質量(200±20)g，動物房中適應性飼養(yǎng)1周，室溫(22±5)℃，相對濕度(50±5)%，通風良好，環(huán)境安靜，自由飲水、攝食。實驗動物購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心。所有動物實驗均經倫理委員會批準。

1.2 實驗試劑 人參總皂苷 Rg1(浙江康恩貝制藥股份有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國PeproTech公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；Trizol裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量逆轉錄試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒均購自日本TaKaRa公司；兔抗鼠β-actin單克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2單克隆抗體、兔抗鼠Bax單克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3單克隆抗體均購自美國Abcam公司；Tunel試劑盒(美國Roche公司)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、蛋白上樣緩沖液均購自中國上海碧云天生物工程研究所；多聚甲醛、無水乙醇均產自天津化學試劑廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與模型構建 本研究采用高脂飲食飼養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射垂體后葉素構建大鼠冠心病模型，每日高脂飲食連續(xù)飼養(yǎng)6周后，間隔24 h腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg，連續(xù)3次[6]。實驗大鼠隨機分為對照組、模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組，每組10只。對照組常規(guī)飲食，不進行冠心病造模，給予人參皂苷Rg1等體積生理鹽水灌胃，每日1次；模型組構建冠心病模型，給予人參皂苷Rg1等體積生理鹽水灌胃，每日1次；人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組均構建冠心病模型，術后分別給予50 mg/kg、75 mg/kg、100 mg/kg人參皂苷Rg1灌胃，每日1次。所有實驗動物均連續(xù)灌胃12周。

1.3.2 心肌組織缺血區(qū)細胞形態(tài)觀察 斷頭法處理實驗大鼠，各組大鼠取適量心肌均勻切成5片，每片厚度約為2.0 mm，置于包埋盒內，浸于4%多聚甲醛中固定過夜。常規(guī)乙醇梯度脫水，隨后取出，置于包埋機中2 h進行石蠟包埋。隨后將切片置于二甲苯及梯度乙醇中依次浸泡脫蠟，采用蘇木素染色40 s，1%鹽酸乙醇沖洗后，置于伊紅溶液中染色3 s后自來水沖洗。沖洗后將切片置于梯度乙醇及二甲苯溶液中進行脫水和透明處理。使用中性樹脂覆蓋玻片進行封固。于光學顯微鏡下觀察并采集圖片，應用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件處理并作統(tǒng)計。

1.3.3 心肌組織中炎性因子含量檢測 每只大鼠取心肌組織約50 mg，制成10%的勻漿液，3 000 r/min，4 ℃下離心10 min，收集上清液，采用ELISA試劑盒檢測上清液中白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。使用酶標儀(美國Molecular Devices)在450 nm下測定OD值。所有實驗重復3次。

1.3.4 SOD、MDA含量檢測 每只大鼠取心肌組織約50 mg，于預冷生理鹽水中漂洗后，除去血液，采用手術剪將心肌組織塊剪碎，轉移至勻漿管中，制成10%的組織漿液。3 000 r/min離心10 min，使組織勻漿化，取上清液，嚴格按照各個試劑盒說明書操作，檢測心肌組織SOD活性及MDA含量。所有實驗重復3次。

1.3.5 凋亡相關蛋白 mRNA表達情況檢測 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測心肌組織中凋亡相關蛋白 mRNA表達情況。采用Trizol法提取各組大鼠心肌組織細胞總RNA。采用紫外分光光度儀測定總RNA濃度與純度，A260/280在1.8～2.0。參照mRNA反轉錄試劑盒操作說明進行反轉錄和RT-PCR檢測，反應程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，40個循環(huán)，最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s收集熒光信號，計算相對定量結果，所有實驗重復3次。Bax、Bcl-2、Caspase-3引物及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成。

1.3.6 凋亡相關蛋白表達情況檢測 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測心肌組織中凋亡相關蛋白表達情況。每只大鼠取心肌組織約50 mg，加入組織蛋白提取液，4 ℃充分碾磨10 000 r/min離心10 min，取上清液。采用BCA 蛋白定量試劑盒對提取的蛋白進行定量，各組以30～60 μg 相同的蛋白上樣量，煮沸變性后進行凝膠電泳，隨后使用半干轉儀轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脫脂牛奶封閉 1 h，抗Bax單克隆抗體(1∶1 000)、抗Bcl-2單克隆抗體(1∶1 000)、抗Caspase-3單克隆抗體(1∶800)4 ℃孵育過夜。PBS-Tween 20液漂洗，HRP標記的二抗反應，PBS-Tween 20液洗膜，化學發(fā)光法(ECL)顯色，凝膠成像儀曝光拍照。檢測各組實驗大鼠心肌組織中Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡標志蛋白表達情況。所有實驗重復3次，灰度值采用Image Pro Plus 6.0軟件檢測分析。

2 結 果

2.1 5組心肌組織細胞形態(tài)比較 光學顯微鏡下觀察，對照組大鼠心肌組織細胞形態(tài)正常，排列整齊，細胞核膜完整，核仁清晰可見，無明顯核固縮表現；模型組大鼠心肌組織細胞體積明顯縮小，核固縮明顯，呈深染色表現，細胞水腫明顯，細胞間隙有明顯的細胞浸潤表現，可見明顯的壞死細胞；人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組大鼠心肌組織細胞水腫狀態(tài)均較模型組有所改善，細胞水腫狀態(tài)呈現不同程度減輕，其中，人參皂苷Rg1高劑量組細胞腫脹程度緩解最為明顯，其細胞核深染明顯減輕，細胞皺縮明顯緩解，細胞形態(tài)基本趨于正常。詳見圖1。

圖1 5組心肌組織細胞形態(tài)比較

2.2 5組心肌組織炎性因子含量比較 與對照組比較，模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1中劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心肌組織炎性因子含量比較 () 單位：ng/L

2.3 5組SOD活性及MDA含量比較 與對照組比較，模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1中劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 5組SOD活性及MDA含量比較 ()

2.4 5組凋亡相關蛋白mRNA表達比較 與對照組比較，模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3 mRNA表達水平明顯升高，Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3 mRNA表達水平明顯降低，Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1中劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3 mRNA表達水平明顯降低，Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3 mRNA表達水平明顯降低，Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖2。

圖2 5組凋亡相關蛋白mRNA表達比較

2.5 5組凋亡相關蛋白表達比較 與對照組比較，模型組、人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組、人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1中劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與人參皂苷Rg1低劑量組比較，人參皂苷Rg1高劑量組Bax及Caspase-3蛋白表達水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖3。

圖3 5組凋亡相關蛋白表達比較

3 討 論

冠心病是一類常見的嚴重危害人類健康的心血管系統(tǒng)疾病，其發(fā)生與動脈粥樣硬化、血管再狹窄、心肌缺血再灌注損傷等密切相關[7]。研究顯示，心肌細胞凋亡在動脈粥樣硬化、心肌缺血、再灌注損傷以及急性心肌梗死等心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[8]。細胞凋亡又稱為程序性細胞死亡，是細胞自我有效消亡的過程，在形態(tài)特征上有別于細胞壞死，但同屬于細胞死亡[9]。隨著對冠心病發(fā)病機制研究的不斷深入，心肌細胞凋亡與冠心病的關系逐漸成為臨床研究的熱點話題。

人參皂苷是人參的主要活性成分，對神經系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有不同程度的保護作用，尤其在心血管系統(tǒng)疾病的防治中具有重要意義[10]。人參皂苷Rg1屬于人參三醇型皂苷，有研究顯示，人參皂苷Rg1對缺血心肌具有保護作用，不僅可通過與糖皮質激素受體結合，促進血管內皮細胞產生一氧化氮(NO)，擴張冠狀動脈，增加冠狀動脈血流量，保護心肌功能，還可通過降低缺血缺氧心肌細胞內鈣離子濃度，調節(jié)心肌細胞內鈣離子平衡紊亂，保護心肌細胞[11-12]。近年來研究發(fā)現，人參皂苷Rg1在血管新生方面也具有積極作用，可通過促進內皮細胞增殖、遷移，參與血管重構與新生，從而發(fā)揮心肌保護作用[13-14]。此外，人參皂苷Rg1在一定程度上可增加冠心病病灶區(qū)的血管密度，提高血管內皮生長因子表達，在急性心肌梗死中發(fā)揮保護作用[15]。人參皂苷Rg1已作為復方制劑的成分之一投入到臨床使用中，目前臨床上廣泛應用的血栓通注射液的主要成分即為人參皂苷Rg1，但目前人參皂苷Rg1心肌保護作用的研究多在細胞水平，人參皂苷Rg1通過何種途徑影響冠心病的發(fā)展和預后仍不清楚。本研究以人參皂苷Rg1對冠心病心肌細胞凋亡的分子機制為切入點，以大鼠冠心病模型為研究對象，探討人參皂苷Rg1影響心肌細胞凋亡的可能機制。

本研究結果顯示，給予人參皂苷Rg1不同劑量干預后，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組大鼠心肌細胞水腫狀態(tài)均較模型組改善，細胞水腫狀態(tài)呈現不同程度減輕，提示人參皂苷Rg1對于緩解心肌細胞水腫有一定作用，且人參皂苷Rg1高劑量組細胞腫脹程度緩解最為明顯。IL-1β是炎癥反應的重要介質，可通過刺激黏附分子異常高表達，介導粒細胞在血管內皮細胞間的黏附和浸潤，還可通過刺激血管內皮細胞，誘導相關血管活性物質的合成與分泌，促進微血栓的形成[16]。IL-6在缺血再灌注損傷發(fā)病早期即可通過異常高表達刺激炎性細胞介質釋放發(fā)揮促炎作用[17]。TNF-α作為一種常見的炎性因子，在眾多炎癥中均有著明顯的異常表達，主要在炎癥發(fā)生的初始階段發(fā)揮前炎性因子作用[18]。本研究結果顯示，模型組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯高于人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組(P<0.05)，且人參皂苷Rg1高劑量組大鼠心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯低于人參皂苷Rg1低、中高劑量組(P<0.05)，提示人參皂苷Rg1能有效抑制冠心病發(fā)生過程中的炎癥反應，且其對心肌細胞損傷的抗炎效應與劑量密切相關。SOD廣泛存在于人體，是心肌組織中清除自由基的有效成分，MDA是脂質過氧化的最終產物，可通過干預氧自由基的生成量間接反映細胞損傷的程度[19-20]。本實驗結果顯示，模型組SOD活性明顯低于人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組(P<0.05)，而MDA含量明顯高于人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組(P<0.05)，表明人參皂苷Rg1能增強冠心病大鼠心肌組織中SOD活性，同時降低MDA水平，從而減輕氧自由基的破壞作用，保護心肌細胞，與其抗炎作用一致。與模型組比較，人參皂苷Rg1低劑量組、人參皂苷Rg1中劑量組及人參皂苷Rg1高劑量組大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表達量明顯降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA及蛋白表達量則明顯升高(P<0.05)，提示人參皂苷Rg1對冠心病心肌組織細胞凋亡具有一定的抑制作用。本研究實驗結果表明，人參皂苷Rg1在降低炎癥水平及氧自由基作用的同時，還可抑制心肌細胞凋亡，其抑制凋亡效應可能與線粒體凋亡信號通路的失活有關。

綜上所述，人參皂苷Rg1可通過降低損傷后炎癥反應、抗氧化、抑制線粒體凋亡信號通路作用，發(fā)揮對冠心病大鼠心肌細胞的保護作用，其作用效果與干預劑量明顯相關。