楊斌，方柄棟，鄭峻，單燦燦，李佳歡，3，程泳春，孫淑靜，3，胡開輝，3*，金文松，3*

（1.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2.福建省食用菌技術推廣總站，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學（古田）菌業(yè)研究院，福建 寧德 352200；4.福建珍菌子生物科技有限公司，福建 寧德 352200）

鹿茸菇，學名荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes），分類學地位為擔子菌綱，傘菌目，白蘑科，離褶傘屬，主要分布在我國的四川、云南、青海等地區(qū)。鹿茸菇營養(yǎng)豐富[1]，風味獨特，口感鮮美，已流行成為百姓餐桌上的一道美食；多篇文獻報導鹿茸菇含有多種生物活性物質(zhì)（多糖、嘌呤、甾醇等）[2-3]，具有抗氧化[4-6]、抗腫瘤[7-9]、降血脂[10]、降血糖[11]等多種藥用活性。

抗氧化劑是一類可以干擾自由基連鎖反應，清除體內(nèi)多余自由基的物質(zhì)，根據(jù)來源不同可分為化學合成抗氧化劑和天然抗氧化劑?；瘜W合成抗氧化劑相較于天然抗氧化劑具有工藝成熟、價格低廉、性能穩(wěn)定等優(yōu)勢，因而目前市面上常見的抗氧化劑主要以化學合成為主，但是其對人體存在較大的副作用，安全性低，不宜大范圍推廣使用；天然抗氧化劑主要來自于果蔬、中草藥、大型真菌，如維生素C、多酚類、生物堿等，來源廣泛、綠色安全，具有大范圍開發(fā)應用的潛力。近年來為豐富天然抗氧化劑的來源，提升食用菌的綜合利用價值，研究人員對香菇[12]、金針菇[13]、杏鮑菇[14]、姬松茸[15]、靈芝[16]、桑黃[17-18]、灰樹花[19]、海鮮菇[20-21]等常見食藥用菌子實體中多酚的提取工藝和抗氧化活性進行了探究和報道。鹿茸菇是近年來新興的工廠化栽培藥食兼用菌，具有較高的營養(yǎng)價值，但是目前鹿茸菇的研究主要集中于工廠化栽培工藝方面，關于活性成分功能的相關研究較少，因而本試驗以鹿茸菇為試材，采用響應面設計對超聲輔助水提鹿茸菇多酚工藝進行優(yōu)化，并對其體外抗氧化活性進行探究，為提升鹿茸菇的綜合利用價值奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹿茸菇干品：福建珍菌子生物科技有限公司；無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、十二水合磷酸鈉、福林酚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；無水碳酸鈉、四水合鉬酸銨（均為分析純）：西隴化工有限公司；1-1-二苯基-2-三硝基本肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH，純度≥97%）：梯希愛（上海）化成工業(yè)有限發(fā)展公司；2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS，純度≥98%]：北京索萊寶科技有限公司；維生素C（純度≥99%）：美國Sigma公司；沒食子酸（純度≥99%）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

高速多功能粉碎機（HC-700）：永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；數(shù)控超聲波清洗器（KH-500DE）：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；多功能酶標儀（3020）：賽默飛世爾科技有限公司；高速冷凍離心機（2-16KL）：美國Sigma公司；電熱恒溫水浴鍋（DK-S24）：上海一恒儀器科技有限公司；電子天平（AL204）：梅特勒托利多（上海）有限公司；紫外分光光度計（T6）：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 原材料預處理

將鹿茸菇干品用粉碎機粉碎，過60目篩，制成鹿茸菇粉末備用。

1.3.2 多酚含量測定

精確配制不同濃度的沒食子酸標準液，多酚含量測定的反應體系按照張梅梅等[22]的測定方法，于750 nm測定標準液吸光度，以標準液濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線（圖1），線性回歸方程為y=10.308x+0.009 7，R2=0.999 4。取不同條件下制備的多酚水溶液，在750 nm處測定吸光度，按照式（1）計算多酚得率。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve for determination of gallic acid

式中：c為標準曲線計算所得的多酚濃度，mg/mL；V為提取液總體積，mL；m為干粉質(zhì)量，g；D為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 鹿茸菇多酚提取單因素試驗

稱取鹿茸菇粉末各1 g，分別探究不同溶劑（水、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯）；不同液料比[40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1（mL/g）]；不同提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）；不同提取時間（40、50 、60、70 、80、90、100、110 min）；不同超聲功率（200、250、300、350、400、450、500 W）對鹿茸菇多酚得率的影響。

1.3.4 響應面工藝優(yōu)化

選取 A（液料比），B（提取溫度），C（提取時間），D（超聲功率）4個因素，基于單因素試驗結果，采用Box-Beheken設計，以多酚得率為響應值，對超聲水提鹿茸菇多酚工藝進行優(yōu)化，根據(jù)Design-Expert 8軟件設計了29組試驗。

表1 Box-Behnken設計因素水平編碼Table 1 Codes and levels of factors in Box-Behnken design

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 總抗氧化能力測定

反應體系參考梁引庫等[23]的測定方法，待反應結束后，取反應液于695 nm處測定吸光度，以去離子水作空白，維生素C作陽性對照，每個濃度3個平行，取平均值。

1.3.5.2 DPPH自由基清除能力測定

反應體系參考Ma等[24]的測定方法，于515 nm處測定樣品吸光度（As），以水作為空白對照測得吸光度（Ac），以無水乙醇代替DPPH工作液測得本底吸光度（Aj），每個濃度3個平行，以維生素C作陽性對照，按照式（2）計算DPPH自由基清除率。

1.3.5.3 ABTS+自由基清除能力測定

反應體系參考Re等[25]的測定方法，于734 nm處測定樣品吸光度（As），以水作空白測得空白吸光度（Ac），以無水乙醇代替ABTS工作液測得樣品本底吸光度（Aj），每個濃度3個平行，以維生素C作為陽性對照，按照式（3）計算ABTS+自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗結果取3次平行試驗的平均值，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，應用Graphpad prism 6軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同溶劑對多酚得率的影響

不同溶劑對多酚得率的影響見圖2。

圖2 不同溶劑對多酚得率的影響Fig.2 Effects of different solvents on the yield of polyphenols

由圖2可知，以水作為提取溶劑，多酚得率最高，表明鹿茸菇多酚易溶于水，出于高提取效率和經(jīng)濟節(jié)約的原則，后續(xù)試驗選擇以水作為提取溶劑。

2.1.2 不同液料比對多酚得率的影響

不同液料比對多酚得率的影響見圖3。

圖3 不同液料比對多酚得率的影響Fig.3 Effects of different liquid-solid ratio on the yield of polyphenols

由圖3可知，多酚得率隨著液料比的增加整體呈先上升后趨于穩(wěn)定的趨勢，當液料比為70∶1（mL/g）時，多酚得率最高。試驗結果表明增大液料比的比值可有效提升多酚得率，這主要是因為當樣品量一定時，隨著提取溶劑體積的增加，樣品與溶劑接觸的表面積增大，從而提高了胞內(nèi)多酚的溶出效率。

2.1.3 不同提取溫度對多酚得率的影響

不同提取溫度對多酚得率的影響見圖4。

圖4 不同提取溫度對多酚得率的影響Fig.4 Effects of different extraction temperatures on the yield of polyphenols

由圖4可知，在30℃～60℃，升高溫度有利于多酚提取，提取溫度為60℃時，多酚得率最高。這可能是因為提取溫度低，胞內(nèi)多酚的溶出效率低，而多酚類物質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，提取溫度過高，可能會引起多酚氧化降解或結構受到破壞，導致多酚得率下降。

2.1.4 不同提取時間對多酚得率的影響

不同提取時間對多酚得率的影響見圖5。

圖5 不同提取時間對多酚得率的影響Fig.5 Effects of different extraction time on the yield of polyphenols

由圖5可知，提取時間在40 min～110 min時，多酚得率隨著提取時間的延長整體呈先上升后下降的趨勢，提取時間為90 min時，多酚得率最高。這可能是因為提取時間過短，胞內(nèi)多酚未能完全溶出，隨著提取時間的延長，胞內(nèi)多酚逐漸溶出，胞內(nèi)胞外多酚濃度趨于飽和，多酚得率逐漸上升。

2.1.5 不同超聲功率對多酚得率的影響

不同超聲功率對多酚得率的影響見圖6。

圖6 不同超聲功率對多酚得率的影響Fig.6 Effects of different ultrasonic power on the yield of polyphenols

由圖6可知，超聲功率在200 W與250 W時，多酚得率基本相當；當超聲功率超過250 W時，多酚得率大幅下降。試驗結果表明大額功率超聲不利于多酚提取。

2.2 響應面優(yōu)化試驗

2.2.1 回歸方程的建立

以單因素試驗數(shù)據(jù)為參考，選取液料比、提取溫度、提取時間、超聲功率4個因素進行四因素三水平的提取工藝優(yōu)化試驗，Box-Behnken設計與結果如表2所示。

表2 Box-Behnken設計及試驗結果Table 2 Box-Behnken design and the corresponding experimental results

續(xù)表2 Box-Behnken設計及試驗結果Continue table 2 Box-Behnken design and the corresponding experimental results

整理29組試驗數(shù)據(jù)并利用Design Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，擬合得到二次回歸方程：Y=16.13+0.27A-0.22B+0.02C-0.098D-0.29AB-0.14AC-0.042AD-0.067BC-0.22BD-0.048CD-0.27A2-1.09B2-0.33C2-0.52D2。

2.2.2 模型方差分析

響應面模型方差分析結果如表3所示。

表3 回歸方程方差分析結果Table 3 Results of quadratic regression model for response surface analysis

由表 3 可知模型 F 值=19.49，（Prob>F）<0.000 1，高度顯著；而失擬項F值=1.21，（Prob>F）=0.457 2>0.05，不顯著，表明所建模型可用于預測實際多酚得率，且具有統(tǒng)計學意義。相關系數(shù)R2=0.957 9，AdjR2=0.908 7，C.V.%值僅為1.18，以上分析結果表明所建模型與實際試驗結果的擬合程度高，約90.87%的鹿茸菇多酚得率可用該模型來預測和描述，可應用于后續(xù)試驗。

2.2.3 多酚得率響應面分析

由表3可知，液料比和提取溫度兩因素之間的交互作用對多酚提取得率的影響達極顯著水平（P<0.01）。為較為直觀的觀察因素變化對多酚提取得率變化的影響，根據(jù)所擬合出的二次回歸方程，利用Design Expert 8.0.6軟件繪制的3D曲面圖如圖7～圖9所示。

圖7 液料比和提取溫度、液料比和提取時間之間的交互作用對多酚得率的影響Fig.7 Effect of interaction between liquid-to-material ratio and temperature，liquid-to-material ratio and time on the yield of polyphenols

提取溫度 55 ℃～65 ℃，液料比為 70∶1（mL/g）～80∶1（mL/g）時，多酚得率較高；提取時間 85 min～95 min，液料比 70∶1（mL/g）～80∶1（mL/g）時，多酚得率較高（圖 7）。超聲功率 225W～275W，液料比70∶1（mL/g）～80∶1（mL/g）時，多酚得率較高；提取時間 85min～95 min，提取溫度60℃～65℃時，多酚得率較高（圖8）。超聲功率225 W～275 W，提取溫度60℃～65℃時，多酚得率較高；超聲功率225 W～275 W，提取時間85 min～95 min時，多酚得率較高（圖9）。分析等高線圖可知，所有的等高線均呈橢圓形，表明分析因素間存在一定的交互作用，其中提取溫度和液料比之間的交互作用對多酚得率具有決定性的影響（圖7）。綜合方差分析與曲面圖分析結果表明，因素間的交互作用對多酚得率不起主導作用，鹿茸菇多酚得率主要受到單個因素的影響。

圖8 液料比和超聲功率、提取溫度和提取時間之間的交互作用對多酚得率的影響Fig.8 Effect of the interaction between liquid-to-material ratio and power，temperature and time on the yield of polyphenols

圖9 提取溫度和超聲功率、提取時間和超聲功率之間的交互作用對多酚得率的影響Fig.9 Effect of interactions between temperature and power，time and power on the yield of polyphenols

2.2.4 最優(yōu)試驗條件驗證

經(jīng)單因素設計與響應面優(yōu)化設計得出鹿茸菇多酚的最佳提取工藝為液料比76.01∶1（mL/g）、提取溫度58.27℃、提取時間89.3 min、超聲功率246.14 W，多酚最大理論得率為16.760 mg/g。結合實驗室的實際條件對上述工藝參數(shù)稍作改動，液料比為76∶1（mL/g）、提取溫度60℃、提取時間90 min、超聲功率250 W，多酚得率為（16.591±0.173）mg/g，與理論得率較為接近，表明所建模型能對鹿茸菇多酚實際提取得率進行預測，擬合程度高。

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 總抗氧化能力

多酚提取物和維生素C總抗氧化能力見圖10。

圖10 多酚提取物和維生素C總抗氧化能力Fig.10 Total antioxidant capability of polyphenol extract and vitamin C

由圖10可知，在0.04 mg/mL～0.20 mg/mL濃度范圍內(nèi)，鹿茸菇多酚提取物的總抗氧化能力隨著濃度的增加逐漸上升，但整體略低于維生素C；根據(jù)線性擬合的結果，分別計算出了多酚提取物和維生素C的EC50，其中多酚提取的 EC50數(shù)值（0.123 mg/mL）與維生素C（0.114 mg/mL）較為接近。以上試驗結果表明鹿茸菇多酚具有較強的總抗氧化能力。

2.3.2 DPPH自由基清除能力

多酚提取物和維生素C對DPPH自由基的清除能力見圖11。

圖11 多酚提取物和維生素C DPPH自由基清除能力Fig.11 DPPH free radical scavenging ability of polyphenol extract and vitamin C

由圖11可知，在0.04 mg/mL～0.20 mg/mL濃度范圍內(nèi)，鹿茸菇多酚提取物對DPPH自由基的清除能力與多酚劑量成正相關；根據(jù)線性擬合的結果，鹿茸菇多酚提取物的IC50=0.303 mg/mL，維生素C的IC50=0.191 mg/mL。試驗結果表明鹿茸菇多酚提取物具備清除DPPH自由基能力，但弱于維生素C。

2.3.3 ABTS+自由基清除能力

多酚提取物和維生素C對ABTS+自由基的清除能力見圖12。

圖12 多酚提取物和維生素C ABTS+自由基清除能力Fig.12 ABTS+free radical scavenging ability of polyphenol extract and vitamin C

由圖12可知，在0.004 mg/mL～0.020 mg/mL濃度范圍內(nèi)，鹿茸菇多酚提取物對ABTS+自由基清除率的大小隨著濃度增加而逐漸上升；根據(jù)線性擬合結果，分別計算出了鹿茸菇多酚提取物和維生素C的IC50值，其中鹿茸菇多酚提取物對ABTS+自由基表現(xiàn)出較強的清除活性，IC50數(shù)值（0.008 3 mg/mL）與維生素C（0.005 2 mg/mL）大小基本相等。

3 討論與結論

近年來，研究人員為提升多酚得率，將傳統(tǒng)提取方法與現(xiàn)代新興技術相結合，對高效多酚提取工藝進行了探究和報道。Wen等[12]探究了顆粒度、提取時間、功率、液料比等因素對微波輔助有機溶劑提取香菇多酚的影響，發(fā)現(xiàn)顆粒度 1.75 nm，液料比 40∶1（mL/g），微波功率600 W，提取15 min，多酚得率較高；毛榮良等[26]對乙醇提取猴頭菇多酚工藝進行了優(yōu)化，最佳工藝：60%乙醇溶液，液料比 15∶1（mL/g），55 ℃水浴提取，多酚得率為16.701 mg/g；李麗等[27]對超聲輔助乙醇提取保山桃紅牛肝菌多酚工藝進行了優(yōu)化，最優(yōu)工藝：50%乙醇溶液，液料比 30∶1（mL/g），100 W，超聲提取50 min，多酚得率為7.76 mg/g。本試驗對超聲輔助水提鹿茸菇多酚工藝進行了優(yōu)化，最佳工藝：液料比76∶1（mL/g），250 W，60 ℃，提取 90 min，多酚得率為（16.591±0.173）mg/g，在本試驗中鹿茸菇多酚的提取得率要遠高于文獻[27]報道的牛肝菌多酚提取得率，表明本提取工藝的提取效率較高，且具有經(jīng)濟節(jié)約、操作簡單等優(yōu)勢，具有應用與實踐生產(chǎn)的潛力。

建立自由基體外清除分析系統(tǒng)，如DPPH、ABTS+自由基等體系，可快速有效地對抗氧化活性成分進行篩選。王靜等[28]研究發(fā)現(xiàn)采用熱回流法提取的松茸多酚對ABTS+自由基展現(xiàn)出較強的清除能力，IC50=0.271 mg/mL；李彥坡等[29]研究發(fā)現(xiàn)松毛菇多酚能有效清除反應體系中的·OH、O2-·、DPPH·等自由基，且清除率大小與濃度具有劑量依賴效應；徐勝平等[30]研究發(fā)現(xiàn)4種云南野生牛肝菌（銅色牛肝菌、雙色牛肝菌、美味牛肝菌以及灰褐牛肝菌）對DPPH自由基和ABTS+自由基均表現(xiàn)較強的清除活性，鐵還原力IC50介于0.02和0.04之間。本試驗中鹿茸菇多酚總抗氧化EC50=0.123 mg/mL，并能較高效清除DPPH自由基和ABTS+自由基，尤其對ABTS+自由基表現(xiàn)出較大清除活性，IC50=0.008 3 mg/mL，表明鹿茸菇多酚清除ABTS+自由基能力明顯較松茸[28]、海鮮菇（IC50=0.94 mg/mL）[20-21]強。本研究結果表明鹿茸菇作為新興的一種食用菌工廠化品種，其多酚具有較強的抗氧化活性，具有開發(fā)成抗氧劑的潛力。