何子涵， 張佳凝， 全英杰， 任鏝蓉， 楊雯婷， 高 日

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

bHLH(basic Helix-Loop-Helix)轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用[1]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子包含保守的bHLH結(jié)構(gòu)域，由1個(gè)位于N端的堿性區(qū)域(Basic rigion)和1個(gè)位于C端的α螺旋1-環(huán)-α螺旋2(helix-loop-helix)結(jié)構(gòu)組合而成。Toeldo等[2]將擬南芥中的162個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子劃分為21個(gè)亞家族，Li等[3]將水稻中的167個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子分為22個(gè)亞家族。將植物白楊、苔蘚及藻類與擬南芥、水稻等進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析比較，可分為32個(gè)亞家族[4]。bHLH蛋白參與調(diào)控植物中類黃酮、生物堿、萜類等物質(zhì)合成[5]。在模式植物擬南芥中過(guò)表達(dá)bHLH轉(zhuǎn)錄因子AtTT8和AtEGL3，可以提高類黃酮的含量[6]，在銀杏中，GbbHLH91過(guò)表達(dá)可以調(diào)控黃酮合成途徑中的前期基因，從而提黃酮含量[7]。玉米bHLH類轉(zhuǎn)錄因子LC通過(guò)與R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子C1形成MYB-bHLH復(fù)合體共同調(diào)控黃酮醇合成[8]。在石斛花瓣中DhbHLH1和DhMYB2互作，共同參與調(diào)控花色苷的合成[9]。轉(zhuǎn)錄因子bHLH也可與MYB和WD40 3類轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成MBW 3元復(fù)合物來(lái)調(diào)控類黃酮的生物合成[10]。擬南芥MBW復(fù)合物直接參與花青素晚期生物合成基因(LBGs)的表達(dá)。bHLH在甘藍(lán)、郁金香、矮牽牛等植物中已經(jīng)報(bào)道參與調(diào)控黃酮類化合物合成[11-13]，但在杭白菊還未見(jiàn)報(bào)道。

杭白菊(Chrysanthemummorifolium)為菊科菊屬植物，花中含有綠原酸、木樨草苷、地奧司明、香葉木素等黃酮類化合物，是中草藥的有效成分，具有清除自由基、抗氧化、調(diào)血脂、保護(hù)心血管和降血壓等功效[14-16]。同時(shí)，杭白菊也是一種藥食同源的茶用菊，深受人們的喜愛(ài)。人們對(duì)藥用菊、食用菊更加重視內(nèi)在質(zhì)量?jī)?yōu)劣，育種向著多品種、高要求的方向發(fā)展[17-18]。近些年來(lái)，由于多代扦插繁殖引起種質(zhì)退化，影響杭白菊品質(zhì)下降，而bHLH96基因可能參與黃酮類化合物的合成過(guò)程提升杭白菊品質(zhì)。因此，該研究以杭白菊為材料，通過(guò)克隆bHLH96轉(zhuǎn)錄因子，用生物信息學(xué)分析其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、理化性質(zhì)及預(yù)測(cè)與其結(jié)合的miRNA，為bHLH96基因功能驗(yàn)證提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

杭白菊試管苗培養(yǎng)30 d后，選取試管苗葉片作為實(shí)試材料。

1.2 RNA提取及CmbHLH96的克隆

取杭白菊頂端2～3片葉，Trizol法提取其總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Tiangen)，根據(jù)說(shuō)明書的方法合成cDNA第1鏈，在-20 ℃的條件下保存?zhèn)溆?。根?jù)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的保守序列，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源序列。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物CmbHLH96-F: TTTGGTTTCTTTAGGGTTCA與CmbHLH96-R: ATCATCATAAGGCACAGGGT,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋鹤冃?4 ℃，30 s，退火溫度58 ℃，30 s；延伸72 ℃，90 s；35個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳，切取特異片段，利用瓊脂糖凝膠試劑盒回收片段，連接到pMDT19載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株，送南京斯普金生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 CmbHLH96蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用PredictProtein(https://predictprotein.org/)預(yù)測(cè)CmbHLH96蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，采用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)杭白菊CmbHLH96蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 CmbHLH96蛋白的理化性質(zhì)

利用NCBI CD-Search分析CmbHLH96蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用ExPASy在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)CmbHLH96蛋白的分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)及疏水性等。

1.5 轉(zhuǎn)錄因子CmbHLH96的miRNA預(yù)測(cè)

使用在線工具psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/v1_psRNATarget/? function=2)，對(duì)miRNA進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)。

1.6 CmbHLH96系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

下載bHLH同源基因序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)；運(yùn)用MEGA7.0構(gòu)建NJ (neighbor-joining)樹，缺口設(shè)置complete deletion，模式為p-distance，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap為1 000次

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取及CmbHLH96克隆與分析

以杭白菊葉片為材料，采用Trizol法提取總RNA，可見(jiàn)28 S，18 S和5 S條帶清楚，可以用于基因克隆(圖1)。利用FastQuant cDNA第1鏈合成試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)杭白菊基因組數(shù)據(jù)(http://www.amwayabrc.com/)中獲得的bHLH96(CHR00001268) 片段序列，設(shè)計(jì)保守片段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳發(fā)現(xiàn)在1 000 bp左右有1條明顯亮帶(圖2)。

CmbHLH96基因最大開(kāi)放閱讀框(ORF) 918 bp，編碼306個(gè)氨基酸序列。通過(guò)利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載與CmbHLH96蛋白同源性較高物種氨基酸序列。通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)同源序列進(jìn)行多重對(duì)比，發(fā)現(xiàn)青蒿(PWA87571.1)、除蟲菊(GEU45887.1)、向日葵(XP_021987138.1)、洋薊(XP_024977049.1)和萵筍(XP_023771628.1)都含有1個(gè)helix-loop-helix domian (HLH)結(jié)構(gòu)功能域(圖3)。

2.2 CmbHLH96蛋白的理化性質(zhì)分析

通過(guò)ExPASy網(wǎng)站預(yù)測(cè),CmbHLH96相對(duì)分子量1 121.74 KD，等電點(diǎn)5.06，不穩(wěn)定系數(shù)35.95，CmbHLH96蛋白的總平均親水性0.75，脂肪指數(shù)33.65，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明,CmbHLH96定位于細(xì)胞核中(表1)。預(yù)測(cè)表明CmbHLH96蛋白可能是一個(gè)定位在細(xì)胞核中的穩(wěn)定的酸性親水性蛋白。

表1 CmbHLH96蛋白理化性質(zhì)分析Table 1 Physicochemical properties of CmbHLH96 protein

2.3 CmbHLH96蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)的氨基酸組成決定了蛋白的功能。用PredictProtein (https://predictprotein.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，分析顯示：杭白菊CmbHLH96蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(表2)主要為α螺旋，無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，分別占25.82%、14.71%、59.48%。采用SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)杭白菊CmbHLH96蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4)顯示，該蛋白主要由α-螺旋和延伸鏈組成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

表2 CmbHLH96 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

2.4 CmbHLH96的miRNA預(yù)測(cè)

利用psRNATarget數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)CmbHLH96的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)(表3)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CmbHLH96基因可能受miR7696調(diào)控，miRNA7696序列為AUUAAGUUCUAAUAAUUUAA，與CmbHLH96的作用位點(diǎn)在1 165～1 184 bp。

表3 miRNA的靶標(biāo)預(yù)測(cè)

2.5 CmbHLH96系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為研究CmbHLH96與不同種屬植物家族的關(guān)系，通過(guò)在NCBI核酸序列庫(kù)進(jìn)行檢索，下載同源性較高的不同種屬蛋白質(zhì)序列行比對(duì)分析，并使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建CmbHLH96系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)，CmbHLH96與菊科蒿屬青蒿親緣關(guān)系較近，推測(cè)CmbHLH96基因可能與青蒿的bHLH基因家族功能相近。

青蒿AabHLH(PWA87571.1)、向日葵HabHLH94 (XP_021987138.1)、煙草NsbHLH94-like(XP_009781858.1)、洋薊CcbHLH94-like(XP_024977049.1)、棉GsbHLH(MBA0866875.1)、番茄SlbHLH94-like(XP_004237957.1)、擬南芥AtbHLH94(XP_028052116.1)、擬南芥AtbHLH96、木瓜LtbHLH96-like(XP_031114478.1)、山茶CsbHLH96-like(XP_028052116.1)、獼猴桃AcbHLH96-like(PSS31608.1)、萵苣LsbHLH96 (CAB4103592.1)、甘薇菊MmE3N88(KAD5507496.1)、番薯LnbHLH96-like(XP_019174067.1)。

3 討論與結(jié)論

杭白菊是4大藥用名菊，具有豐富的黃酮成分，是藥用植物的主要活性成分之一[19]。bHLH是黃酮合成過(guò)程中的重要基因，其作用是在類黃酮合成途徑中與MYB和WD40蛋白相互作用，bHLH作為中間橋梁將3者連接形成MBW復(fù)合物，復(fù)合體結(jié)構(gòu)MBW與啟動(dòng)子結(jié)合激活黃酮類化合物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控類黃酮物質(zhì)的代謝[20-21]。葡萄vMYCl基因、獼猴桃AdGL3、棉花GhbHLH106-A等bHLH基因過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)類黃酮物質(zhì)含量的積累[22-24]。在月季、紅梨等植物中詳細(xì)報(bào)道過(guò)bHLH與MYB、WD形成MBW過(guò)程的互作機(jī)制[25-26]。bHLH96是一種未知功能的基因，目前的研究中并未有相關(guān)報(bào)道。通過(guò)該試驗(yàn)研究系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，CmbHLH96與青蒿、向日葵等菊科植物親緣關(guān)系相近，在青蒿中bHLH基因家族中的MYC2、bHLH1、HD1、HD8參與調(diào)控青蒿素(倍半萜內(nèi)酯類化合物)合成途徑中的關(guān)鍵酶基因[27-30]，所以推測(cè)CmbHLH96可能具有相似功能。

miRNA分子通過(guò)堿基配對(duì)與靶mRNA結(jié)合從而在轉(zhuǎn)錄后引起靶mRNA的剪切或翻譯的抑制，從而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)[31]。在植物中miRNA可參與黃酮類化合物合成過(guò)程中bHLH基因的表達(dá)，如novel 87調(diào)控bHLH74的表達(dá)，進(jìn)而影響類黃酮的積累[32]。該研究預(yù)測(cè)miRNA7696可能調(diào)控CmbHLH96基因表達(dá)，影響黃酮類化合物的合成，合成機(jī)制有待研究。