楊少娟，陳雪梅，沈 銳，安德鳳，蔡漢欽，姜明國，姜 怡**

(1.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650091；2.廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530008)

0 引言

新發(fā)傳染病(Emerging Infectious Diseases,EIDs)和多重耐藥性病原菌(Multidrug-resistant pathogens)對人類健康造成嚴(yán)重威脅[1,2]。然而，近年來由于陸生微生物的新型抗生素逐漸減少，且分離重復(fù)性逐漸升高[3]，從新的、未開發(fā)的、極端的環(huán)境中分離新菌株成為開發(fā)新型天然產(chǎn)物的有效來源[4-6]。在海平面以下，壓力隨深度的增加而增加，溫度、氧氣、光照強度隨深度的增加而減少。因高壓、低溫、缺乏光照、鹽度和氧氣濃度可變，海洋成為一個獨特的極端環(huán)境[7]。為適應(yīng)極端環(huán)境，海洋生物已進化出獨特的生理、生化功能[8,9]。獨特的海洋環(huán)境，使海洋微生物具備與陸生微生物不同的特征，可能產(chǎn)生新的生物活性成分和新型抗生素[10]。目前有關(guān)海洋微生物的研究表明：海洋微生物，特別是海洋放線菌能產(chǎn)生新型代謝產(chǎn)物，且部分代謝產(chǎn)物具有新的生物活性，可用于新藥的開發(fā)[11,12]。

地處熱帶和亞熱帶的廣西北部灣海域，蘊含著豐富的海洋細(xì)菌資源[13]。但目前對廣西北部灣海域海洋微生物的研究主要集中于北部灣灘涂的紅樹林保護區(qū)，關(guān)于該海域海洋沉積物細(xì)菌多樣性及生物活性潛力的研究鮮見報道。因此，本研究利用高通量測序技術(shù)結(jié)合純培養(yǎng)分離技術(shù)，對廣西北部灣局部海域海洋沉積物的細(xì)菌多樣性進行研究，同時對純培養(yǎng)菌株的生物活性潛力進行評估，為該海域海洋細(xì)菌資源的開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

溶菌酶、蛋白酶 K、Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、Marker購自昆明云科生物技術(shù)有限公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。由昆明擎科生物科技有限公司合成PCR所用引物。PCR 擴增儀，Biometra公司；電泳儀，Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，Gene Company Limited公司。

1.2 樣品采集

2020年11月，用抓斗取樣器從廣西北部灣海域采集海洋沉積物。采樣的間隔距離為50 m，停船后在船頭用抓斗取樣5-10次，5-10個點混為一個樣品(共4份)，并將樣品全部裝入無菌密封袋中，立即用冰盒運輸至實驗室，4.0℃冰箱保存。樣品信息如表1所示。

表1 廣西北部灣海洋沉積物樣品采集信息

1.3 高通量測序與分析

1.3.1 高通量測序樣品處理

所采集的4份樣品為混合樣品，為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，每份樣品做3個重復(fù)。

1.3.2 PCR擴增與高通量測序

利用試劑盒提取海洋沉積物樣品總DNA。根據(jù)編碼細(xì)菌核糖體RNA的核酸序列保守區(qū)設(shè)計引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，對樣品總DNA進行PCR擴增。30.0 μL PCR擴增體系：Buffer 15.0 μL、 dNTPs 6.0 μL、338F 0.9 μL、806F 0.9 μL、KOD FX Neo酶 0.6 μL、基因組DNA 50.0 ng，加ddH2O補至 30.0 μL。PCR擴增程序：98℃ 2 min；98℃ 0.5 min，50℃ 0.5 min，72℃ 1.0 min，30個循環(huán)；72℃ 5.0 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化、定量和均一化后形成測序文庫，質(zhì)檢合格后用Illumina HiSeq 2500進行測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

高通量測序獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理后，用Usearch軟件[14]對在97.0%相似度水平上的序列進行聚類，獲得操作分類單元(Operational Taxonomic Unit,OTUs)。對OTUs進行物種注釋，在界、門、綱、目、科、屬、種水平上分析各樣品的細(xì)菌群落組成及組間差異。采用α多樣性分析單個樣品的物種豐度及物種多樣性，其中用Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度，其值與物種豐度成正比；用Shannon和Simpson指數(shù)衡量物種多樣性，其值與物種多樣性成正比。采用β多樣性分析不同樣品間細(xì)菌群落組成的相似性及差異。

1.4 純培養(yǎng)細(xì)菌的分離與鑒定

1.4.1 培養(yǎng)基

采用6種分離培養(yǎng)基：腐殖酸(HV)[15]、YIM 91[16]、YIM 171[17]、M3[18]、海藻糖-天冬酰胺[19]、幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)培養(yǎng)基配方如下：幾丁質(zhì) 2.0 g/L，K2HPO40.7 g/L，KH2PO40.3 g/L，微量鹽溶液(FeSO4·7H2O 0.1 g，MnCl2·4H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，溶于100.0 mL水) 1.0 mL，海鹽 25.0 g/L，瓊脂 10.0 g/L，pH值為7.2。

上述6個培養(yǎng)基中添加組合抑制劑(25.0 mg/L萘啶酸+50.0 mg/L重鉻酸鉀+100.0 mg/L制霉菌素)抑制生長較快的細(xì)菌和真菌。

純化培養(yǎng)基YIM 38 (g/L)：酵母提取物 4.0，無水葡萄糖 4.0，麥芽提取物 2.5，復(fù)合維生素 10.0 mg，瓊脂 12.0，pH值為7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基YIM 61(g/L)：大豆粉20.0，蛋白胨 2.0，葡萄糖 20.0，可溶性淀粉 5.0，酵母膏2.0，NaCl 4.0，K2HPO40.5，MgSO4·7 H2O 0.5，CaCO32.0，pH值為7.2。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10.0，酵母提取物 5.0，NaCl 10.0，pH值為7.2。

PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯 200.0，葡萄糖 20.0，pH值為7.2。

1.4.2 樣品預(yù)處理與菌株分離

4份灰色砂質(zhì)沉積物樣品分別混合均勻后置于無菌培養(yǎng)皿中，28℃自然干燥7 d。研磨后稱取2.0 g樣品，置于80℃烘箱中干熱處理1.0 h；然后加到18.0 mL無菌0.1% Na4P2O7溶液中，用搖床180.0 r/min震蕩1.0 h；最后用超聲波清洗器處理40.0 s得到樣品懸浮液，并用0.1% Na4P2O7溶液按10-2，10-3比例稀釋。

純培養(yǎng)采用稀釋涂布法，取200.0 μL充分混勻后的10-2，10-3樣品稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)30 d。培養(yǎng)期間挑取菌落形態(tài)不一樣的單菌落接種至YIM 38斜面，28℃培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后根據(jù)菌株形態(tài)特征去除重復(fù)菌株及污染菌株，對剩余菌株進行編號，然后用YIM 38培養(yǎng)基對編號菌株進行擴大培養(yǎng)及純化，用20%甘油管于-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.4.3 菌株鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

純化后的菌株用酶法提取DNA[20]。采用細(xì)菌通用引物PA (5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和PB (5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進行16S rRNA基因擴增。50 μL PCR擴增體系： Buffer 5.0 μL、 dNTPs 4.0 μL、PA 1.0 μL、PB 1.0 μL、Taq DNA 聚合酶 0.3 μL、ddH2O 37.7 μL、模板 DNA 1 μL。PCR擴增程序：94℃ 4 min；94℃ 1.0 min，56℃ 1 min，72℃ 2.0 min，30個循環(huán)；72℃ 10.0 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，將驗證結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物送至昆明擎科生物科技有限公司進行測序。使用EZ Biocloud數(shù)據(jù)庫(https://www.ezbiocloud.net/)將測序得到的16S rRNA基因序列進行比對，確定菌株與已發(fā)表菌株的相似性。采用MAGE 7.0[21]軟件以鄰接法(Neighbour-Joining)[22]構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.5 抗菌活性篩選

1.5.1 指示菌

本研究選用9種臨床和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常見的病原菌作為指示菌進行抗菌活性實驗。革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCGMCC 1.2386)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCGMCC 1.1849)。革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(EscherichiacoliCGMCC 1.2385)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。真菌：黑曲霉(Aspergillusniger)、白色念珠菌(CandidaalbicansCGMCC 2.2086)、小麥赤霉病菌(Gibberellasaubinetii)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、馬鈴薯干腐病菌(Fusariumcoeruleum)。其中有保藏號的指示菌由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供，無保藏號的指示菌由云南省微生物研究所提供。

1.5.2 抗菌活性檢測

待測菌株和指示菌用YIM 38固體培養(yǎng)基進行活化?；罨蟮拇郎y菌株接種到Y(jié)IM 61液體培養(yǎng)基，28℃少量(6.0 mL)發(fā)酵 7 d，取發(fā)酵液進行活性測試，以空白YIM 61培養(yǎng)基作為陰性對照?；罨蟮母锾m氏陽性、革蘭氏陰性指示菌接種到LB培養(yǎng)基，活化后的真菌指示菌接種到PDA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3 d。

抗菌活性檢測采用雙瓊脂擴散法。培養(yǎng)基下層為水瓊脂，瓊脂凝固后加入含有指示菌的YIM 38培養(yǎng)基，并將自制的打孔器置于培養(yǎng)基中。待培養(yǎng)基凝固后取出打孔器，每個孔中加入100.0 μL待測菌株發(fā)酵液，28℃培養(yǎng)24 h，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈并記錄抑菌圈的大小。

1.6 功能基因篩選

1.6.1 功能基因引物

結(jié)合相關(guān)文獻和本實驗室前期研究，設(shè)計并合成7種功能基因的簡并引物，引物信息見表2。

1.6.2 功能基因檢測

根據(jù)設(shè)計的引物，用PCR擴增技術(shù)篩選功能基因。50 μL PCR擴增體系： Buffer 5.0 μL， dNTPs 4.0 μL，正向、反向引物各 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶 0.3 μL，ddH2O 37.7 μL，模板 DNA 1 μL。PCR擴增程序如下：94℃ 4.0 min；94℃ 1.0 min，退火(溫度見表2)1 min，72℃ 2.0 min，30個循環(huán)；72℃ 10.0 min。

表2 篩選功能基因的引物信息

用1.0%瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，并將驗證后結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物送至昆明擎科生物科技有限公司進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 細(xì)菌群落組成

海洋沉積物測序樣品在97.0%相似度水平上進行聚類，共獲得1 407個OTUs。就單份樣品而言，OTUs在組內(nèi)存在較大差異(圖1)，表明組內(nèi)樣品間細(xì)菌群落組成不同，可能是由于測序樣品是混合樣，未混合均勻造成的。

圖1 高通量測序樣品OTUs數(shù)目

對獲得的OTUs進行物種注釋，門分類水平上部分物種的分布及豐度見圖2。結(jié)果顯示,在門水平上，所有樣品中微生物的優(yōu)勢類別相同，均包括變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠屈擾菌門(Chloroflexi)，其中變形菌門的豐度最高。另外，梭桿菌門(Fusobacteria)只在B樣品(B1、B2、B3)中檢測出且有較高的豐度，在其他3個樣品中均沒有檢測出，表明樣品的特異性對梭桿菌門的菌株具有選擇性。在種分類水平上，注釋的OTUs大部分為免培養(yǎng)菌株，表明樣品還具有巨大的可培養(yǎng)細(xì)菌的潛力。

圖2 門分類水平上高通量測序樣品的物種注釋相對豐度

2.1.2α多樣性分析

海洋沉積物樣品α多樣性指數(shù)如表3所示。樣品Ace指數(shù)為1 263.782 7-1 375.893 8，Chao1指數(shù)為1 278.069 0-1 381.254 2，Simpson指數(shù)為0.880 7-0.988 0，Shannon指數(shù)為5.828 7-8.221 0。A3樣品4個指數(shù)均較高，表明該樣品α多樣性最高；B1樣品4個指數(shù)均最低，表明該樣品α多樣性最低。

表3 高通量測序樣品Alpha多樣性指數(shù)

2.1.3β多樣性分析

β多樣性分析樣品間物種組成相似性的結(jié)果如圖3所示。B樣品與其余3種樣品聚類關(guān)系最遠(yuǎn)，樣品間細(xì)菌的組成差異最大；B樣品和D樣品的3個重復(fù)均聚類在一起，體現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，說明同一樣品內(nèi)微生物群落的組成及分布較均勻。但是A樣品和C樣品的3個重復(fù)沒有完全聚類到一起，存在一定的交叉性，即A2和C2樣品表現(xiàn)出較強的聚類關(guān)系，表明這兩個樣品中微生物的組成更為相似。A樣品和C樣品3個重復(fù)樣品沒有完全聚類的原因可能是：(1)A樣品和C樣品的3個重復(fù)組沒有充分混合均勻；(2)兩個采樣地之間物質(zhì)和能量的流動性較強，所形成的環(huán)境相似，所以樣品間的微生物組成也比較相似。

圖3 基于bray curtis算法構(gòu)建的UPGMA聚類樹

2.2 純培養(yǎng)多樣性分析

2.2.1 細(xì)菌多樣性

采用6種分離培養(yǎng)基對廣西北部灣局部海域采集的4份海洋沉積物樣品進行分離，共分離出680株菌。根據(jù)菌株形態(tài)特征去重復(fù)后，對278株菌進行16S rRNA基因測序。經(jīng)EZ Biocloud數(shù)據(jù)庫比對，278株菌分布于3個門：放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、變性菌門(Proteobacteria)，5個綱：放線菌綱(Actinomycetia)、桿菌綱(Bacilli)、α-變性桿菌綱(Alpha-proteobacteria)、β-變性桿菌綱(Beta-proteobacteria)、γ-變性桿菌綱 (Gamma-proteobacteria),16個目： 鏈霉菌目 (Streptomycetale-s)、微球菌目(Micrococcales)、分枝桿菌目(Mycobacteriales)、假諾卡氏菌目(Pseudonocardiales)、丙酸桿菌目(Propionibacteriales)、動孢囊菌目(Kineosporiales)、鏈孢菌目(Streptosporangiales)、微桿菌目(Microbacteriales)、短桿菌目(Brevibacteriales)、嗜皮菌目(Dermatophilales)、纖維單孢菌目(Cellulomonadales)、芽孢桿菌目(Bacillales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、丙桿菌目(Caulobacterales)、伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales)、假單胞菌目(Pseudomonadales),24個科：鏈霉菌科(Streptomycetaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、類諾卡氏菌科(Nocardiaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、丙酸桿菌科(Propionibacteriaceae)、類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)、動孢囊菌科(Kineosporiaceae)、擬諾卡氏菌科(Nocardiopsaceae)、微桿菌科(Microbacteriaceae)、短桿菌科(Brevibacteriaceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、原小單孢菌科(Promicromonosporaceae)、微小桿菌科(Exiguobacteriumf)、游動球菌科(Planococcaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、類芽孢桿菌科(Paenibacillaceae)、Aurantimonadaceae、丙桿菌科(Caulobacteraceae)、草酸桿菌科(Oxalobacteraceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae),31個屬：鏈霉菌屬(Streptomyces)、微球菌屬(Micrococcus)、考克氏菌屬(Kocuria)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、戈登氏菌屬(Gordonia)、紅球菌屬(Rhodococcus)、迪茨氏菌屬(Dietzia)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、Brevilactibacter、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、Thalassiella、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、微桿菌屬(Microbacterium)、農(nóng)球菌屬(Agrococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、巴里恩托斯單孢菌屬(Barrientosiimonas)、原小單孢菌屬(Promicromonospora)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、游動球菌屬(Planococcus)、金黃色微菌屬(Chryseomicrobium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、橙色單孢菌屬(Aurantimonas)、Aureimonas、短波單孢菌屬(Brevundimonas)、馬賽菌屬(Massilia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)。不同屬水平上的菌選取一株菌為代表菌與該屬的典型菌種用鄰接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示。依據(jù)16S rRNA序列相似性小于98.65%用于界定物種界限[31]，序列比對結(jié)果顯示，YIM 150853與NocardioidesglacieisoliHLT3-15T (JQ673418)的相似性最高，但也只有98.23%，表明YIM 150853為1個潛在新分類單元，但具體的分類地位需通過多相分類法[32]確定。

圖4 基于16S rRNA 基因序列構(gòu)建廣西北部灣海域海洋沉積物部分細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2.2 培養(yǎng)基分離效果

通過6種培養(yǎng)基從4份海洋沉積物樣品中分離鑒定出278株菌(31個屬65個種)，每種培養(yǎng)基均分離出一定數(shù)量的細(xì)菌。從種水平上來說，HV培養(yǎng)基分離出19種菌，YIM 91培養(yǎng)基和海藻糖-天冬酰胺培養(yǎng)基各分離出15種菌，YIM 171培養(yǎng)基和幾丁質(zhì)培養(yǎng)基各分離出7種菌，而M3培養(yǎng)基僅分離出3種菌。從屬水平上來說，HV培養(yǎng)基分離出14個屬，YIM 91培養(yǎng)基和海藻糖-天冬酰胺培養(yǎng)基各分離出11個屬，YIM 171培養(yǎng)基分離出6個屬，幾丁質(zhì)培養(yǎng)基和M3培養(yǎng)基各分離出3個屬(圖5)。上述結(jié)果表明，HV作為分離培養(yǎng)基獲得的菌株數(shù)量最多，種屬多樣性最豐富；其次是YIM 91培養(yǎng)基和海藻糖-天冬酰胺培養(yǎng)基，但YIM 91培養(yǎng)基容易生長真菌，不利于細(xì)菌的分離。另外，幾丁質(zhì)培養(yǎng)基雖然分離出4個屬的7種菌，但這些菌株僅從B號樣品中分離得到，表明幾丁質(zhì)培養(yǎng)基有較強的分離特異性，大部分菌株不能利用幾丁質(zhì)作為碳源，作為分離培養(yǎng)基時普適性較差。

圖5 不同培養(yǎng)基分離得到的細(xì)菌屬

2.3 抗菌活性及功能基因篩選

2.3.1 抗菌活性

采用雙層瓊脂擴散法篩選278株細(xì)菌的抗菌活性，結(jié)果表明,有212株(76.25%)細(xì)菌具有抗1種及1種以上指示菌的活性，另外有168株(60.43%)、159株(57.19%)、158株(56.83%)、151株(54.31%)、139株(50.00%)、131株(47.12%)、131株(47.12%)、22株(7.91%)、5株(1.80%)分別對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、馬鈴薯干腐病菌、白色念珠菌、黑曲霉、小麥赤霉病菌、銅綠假單胞菌、番茄灰霉病菌有抑制作用。以上說明，廣西北部灣局部海域海洋沉積物純培養(yǎng)細(xì)菌具有開發(fā)抗生素藥物的巨大潛力。

本實驗中，鏈霉菌屬的菌株表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性，且抑菌活性更強。鏈霉菌YIM 150601對除銅綠假單胞菌、番茄灰霉病菌以外的7種指示菌均有抑菌活性，其中對白色念珠菌的抑菌活性最強，抑菌圈直徑達(dá)16 mm；鏈霉菌YIM 150634對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、馬鈴薯干腐病菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌7種病原菌均有抗菌活性，其中對黑曲霉、馬鈴薯干腐病菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌的抑菌活性最強，抑菌圈直徑均達(dá)15 mm以上(表4)。

表4 純培養(yǎng)菌株的抗菌活性

2.3.2 功能基因

用PCR擴增的方法對可培養(yǎng)菌株的基因組進行功能基因篩選，去重復(fù)后的實驗結(jié)果如表5所示。功能基因篩選結(jié)果表明：36株菌(12.90%)至少含有1類功能基因，11株菌(3.94%)含有2類功能基因。二萜類功能基因的陽性率最高，達(dá)7.89%，其次依次為雷納霉素(4.30%)、鹽霉素(3.94%)、環(huán)縮肽類(1.79%)、PKS-Ⅱ(1.08%)、路鄧素(0.36%)，但未能檢測到含戊二酰亞胺類功能基因的菌株。所篩選到的20株陽性菌株中，15株為放線菌，表明與非放線菌相比，放線菌含有更為豐富的生物合成基因簇，其合成新型天然產(chǎn)物的潛力更大，開發(fā)應(yīng)用價值更大。

表5 基因組中含有功能基因的陽性菌株

3 討論

本研究通過高通量測序技術(shù)對廣西北部灣局部海域海洋沉積物4份混合樣進行測序，結(jié)果顯示3個平行樣品的測序結(jié)果均存在一定差異，可能是樣品混合不均勻所導(dǎo)致。高通量測序旨在客觀、全面地揭示環(huán)境樣品中細(xì)菌多樣性和群落組成，由于高通量測序所需樣品量少，若樣品混合不均勻，則實驗結(jié)果不能真實反映樣品中微生物群落組成。因此，為確保測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，較為全面地揭示環(huán)境樣品中微生物群落的組成及多樣性，采集的樣品應(yīng)充分混合后再進行測序，盡可能減少取樣測序時的人為誤差。

純培養(yǎng)結(jié)果揭示，廣西北部灣局部海域海洋沉積物蘊藏著豐富的細(xì)菌資源。本研究從4份海洋沉積物樣品中分離出278株細(xì)菌，就放線菌而言，鏈霉菌是優(yōu)勢菌，但稀有放線菌(非鏈霉菌)有17個屬，表明海洋生境蘊含著豐富的稀有放線菌資源，與Subramani等[12]報道結(jié)果一致。在屬分類水平上，除放線菌有18個屬外，芽孢桿菌有6個屬，該結(jié)果可能與樣品預(yù)處理有關(guān)：放線菌抗逆性強，80.0℃熱處理1.0 h有利于放線菌孢子萌發(fā)[33]；而芽孢有很強的熱抵抗力，所以分離到的芽孢桿菌也較多[34]。此外，除幾丁質(zhì)培養(yǎng)基外，本實驗所用的5種培養(yǎng)基均是由石松標(biāo)等[16]、王聰?shù)萚18]、彭云霞等[19]、姜怡等[35]、曹艷茹等[36]研究證實的分離細(xì)菌效果較好的培養(yǎng)基，尤其是放線菌。但就本實驗而言，HV培養(yǎng)基分離效果最好，其次是海藻糖-天冬酰胺培養(yǎng)基，而M3培養(yǎng)基的分離效果最差。結(jié)果表明，培養(yǎng)基的分離效果可能受樣品類型、采樣位置等因素的影響。

北部灣海洋微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性豐富。截至2020年，多位研究者已從北部灣海洋微生物中分離出110個化合物，其中53個為新型天然產(chǎn)物[37]。本研究通過抗菌活性和功能基因篩選實驗評估廣西北部灣局部海域海洋沉積物純培養(yǎng)菌株的生物活性潛力?？咕钚越Y(jié)果表明，76.34%的菌株至少對1種指示菌有抑菌活性，其中鏈霉菌YIM 150601、YIM 150634的抑菌譜最廣、抑菌活性最強，YIM 150853為類諾卡氏菌屬(Nocardioides)的1個潛在新分類單元。基于“新產(chǎn)地、新菌種、新基因、新產(chǎn)物”的觀點[38]， YIM 150853應(yīng)該有較好的生物活性，但抗菌活性和功能基因篩選結(jié)果卻表明，YIM 150853對9種指示菌均無抑菌活性，僅篩選到基因組中含有二萜類化合物的基因簇，該菌株具體的生物活性還有待進一步研究。此外，功能基因篩選和抗菌活性結(jié)果顯示，與非放線菌相比，放線菌產(chǎn)生生物活性代謝物的潛力更大，更具有開發(fā)利用的價值。

近年來，來源于海洋放線菌的新型天然產(chǎn)物逐年增加。1997-2017年，研究者從28個屬的海洋放線菌中分離出108種新型天然產(chǎn)物，其中從Salinispora分離的2種天然產(chǎn)物和從鏈霉菌屬分離的1種天然產(chǎn)物處于臨床試驗階段[12,39,40]。2017-2020年，研究者從5個屬的海洋放線菌中分離出50種環(huán)肽類化合物，這些化合物對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌活性，且對鰻弧菌有強烈抑菌活性的環(huán)二肽化合物及其衍生物占68%[41-46]。因此，加強廣西北部灣海域海洋沉積物細(xì)菌資源的研究，特別是放線菌的生物活性研究，有望提高發(fā)現(xiàn)新先導(dǎo)化合物的概率，可為新型藥物的開發(fā)提供候選菌株。

4 結(jié)論

本研究使用高通量測序和純培養(yǎng)技術(shù)對廣西北部灣局部海域海洋沉積物細(xì)菌多樣性進行研究，結(jié)果表明，該海域海洋沉積物中蘊藏著豐富的細(xì)菌資源，但由于現(xiàn)階段純培養(yǎng)技術(shù)的缺陷，僅分離純化出極少部分菌株。對分離出的可培養(yǎng)菌株進行生物活性評估，結(jié)果表明，大量純培養(yǎng)菌株具有抗菌活性，且部分菌株具有產(chǎn)生活性代謝物的基因簇。綜上可知，廣西北部灣海域海洋沉積物除了蘊含豐富的細(xì)菌資源外，還含有豐富多樣的生物合成基因簇及生物活性代謝物。挖掘更多的海洋細(xì)菌資源對于今后開發(fā)具有新的生物活性化合物具有重大意義。