李福德

（福建省安溪縣農業(yè)農村局，福建 安溪 362400）

0 引言

1 材料與方法

1.1 試驗概況

試驗在安溪縣長坑鄉(xiāng)玉美村實施，試驗點海拔637 m，土壤為弱酸性砂壤土，肥力中等，pH值5.8，有機質29.2 mg·kg-1，全氮1.33 mg·kg-1，水解氮138 mg·kg-1，有效磷44.5 mg·kg-1，速效鉀58.5 mg·kg-1。每個小區(qū)建立小田埂，并用地膜進行完全覆蓋，防止不同小區(qū)之間肥水互相串流。中稻種植，前作春種馬鈴薯，4月21日進行播種；每穴插 1～2株；各處理統(tǒng)一施過磷酸鈣360 kg·hm-2，KCl 145 kg·hm-2，施基肥量為總施 N量的40%左右，P2O5的60%，K2O的70%；施分蘗肥為總N的40%，P2O5的40%。穗肥為總N的20%，K2O的30%。施用的氮肥基肥為碳酸氫銨，蘗肥和穗肥為尿素，磷肥為過磷酸鈣，鉀肥為氯化鉀 。移栽后7 d施入分蘗肥，進入幼穗分化2～3期進行穗肥噴施。生長期間，防治2次三化螟、1次卷葉螟、1次紋枯病，未發(fā)生稻瘟病。9月10日收割。

1.2 栽培因子優(yōu)化試驗

1.2.1 試驗方案 以種植密度、田間施氮量、苗期秧齡為試驗因素，以水稻種植產量為目標函數(shù)，用最優(yōu)回歸設計[8-9]，選用“3l1-A”方案，具體的因素水平及編碼見表1。小區(qū)面積 13.34 m2（2 m×6.67 m），設置2次重復 ，共22個不同小區(qū)，每個區(qū)組內均按照隨機排列進行種植[8]。

表1 因素水平及編碼Table 1 Code and levels of factors

1.2.2 田間性狀記載 生長期間，詳細記載播種期、移栽期、齊穗期、成熟期、收割期以及其他具體農事活動。水稻成熟后，各小區(qū)采用五點取樣法選取5叢考種，先割去各小區(qū)的邊行，然后各小區(qū)實割，并進行稱濕谷重，各小區(qū)保留濕谷2.5 kg，然后曬干，稱干谷重，計算曬干率，最后折算小區(qū)干谷重，并進行數(shù)據(jù)分析。

1.3 稻瘟病抗性分析

1.3.1 DNA 提取 水稻基因組DNA的提取采取以下方法：①TPS抽提液置于75 ℃水浴中預熱；②新鮮葉片加液氮磨碎，加入1 mL TPS抽提液，75 ℃水浴30 min，并震動；③12000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，加入等體積的異戊醇并混勻，靜置20 min；④12000 r·min-1離心10 min，棄上清，DNA 沉淀用75%的乙醇洗滌2次，并晾干；⑤加入200～300 μL超純水溶解。

1.3.2 PCR擴增及電泳分析 PCR反應體系20 μL：2×TaqMix 10 μL，DNA模板2 μL，前引物1 μL，后引物1 μL，水6 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min，33個循環(huán)（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物用6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離，主要分為4個步驟：①制膠，6%聚丙烯酰胺變性凝膠；②點樣，待膠完全凝固后，取1.5 μL樣品注入點樣孔；③電泳，調節(jié)電壓至110 V，電泳時間約為0.5 h；④染色，用核酸染料進行染色，利用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照觀察。

1.3.3 稻瘟病抗性基因檢測引物 稻瘟病抗性基因Pi2、Pi9和Pigm檢測標記參照田大剛等[9]的方法。前引物：CTTATTTCGTTTGCTATGC，后引物：GGA CTATGTGATCGGTTAG，引物合成由福州博尚生物科技有限公司完成。特異性引物主要依據(jù)Pi2、Pi9和Pigm基因內部序列的差異進行設計，檢測有132 bp條帶的材料含有Pi9基因，檢測有164 bp條帶的材料含有Pi2基因，檢測有132 bp和164 bp條帶的材料含有Pigm基因。

2 結果與分析

2.1 廣優(yōu)673的主要特征特性

廣優(yōu)673為三系雜交中秈組合，在安溪縣長坑鄉(xiāng)玉美村種植，于4月21日播種，5月20日插秧，8月1日始穗，8月5日齊穗，9月10日收割，全生育期143 d，比對照Ⅱ優(yōu)明86遲熟3 d；取樣考種結果，株高112 cm，有效穗數(shù)228.6 萬穗·hm-2，穗長26.2 cm，每穗總粒數(shù)183.5 粒，結實率86.8%，千粒重31.5 g。廣優(yōu)673參加福建省區(qū)試2年稻瘟病抗性鑒定結果綜合評價為中抗（MR）。廣優(yōu)673的米質表現(xiàn)較一般，根據(jù)農業(yè)農村部稻米及制品質量監(jiān)督檢驗測試中心檢測結果：糙米率81.0%，精米率73.0%，整精米率42.2%，粒長7.2 mm，堊白粒率79%，堊白度13.6%，膠稠度84 mm，堿消值5.2級，透明度2級，直鏈淀粉含量20.5%[10]。

2.2 回歸模型分析

2.2.1 建立回歸模型 根據(jù)實際收割的產量（表2），利用DPS軟件進行統(tǒng)計分析，并依據(jù)每公頃產量與3個試驗處理的回歸方程進行分析，回歸方程為：

民間非營利組織不屬于企業(yè)的范疇，也不屬于政府機構，是一種公共服務組織，為公民提供服務，具有一定的公益性。民間非營利組織，從某些特定的角度來看，和國有非營利事業(yè)單位有一些相似之處，但是仍有許多不同之處。前者更具有民間性，同時非政府性也更加的突出。對于國有非營利事業(yè)單位來說，其資金來源與民間非營利組織是不同的，后者具備典型的民間性。第一，民間非營利組織不屬于政府部門，屬于一種社會組織，并且是獨立運營管理的。第二，民間非營利組織在舉辦一系列活動時，或在運營發(fā)展過程中，都不依靠政府撥款，主要的經(jīng)濟來源是通過社會的捐贈，或者是提供服務來收取一些費用等等。

表2 栽培試驗的產量結果Table 2 Yield of cultivation experiment

2.2.2 檢驗回歸模型 為了明確回歸方程的有效性和準確數(shù)，先進行F檢驗，回歸檢驗的F值為39.70。如果大于F0.01（10，10）=4.85，表明回歸方程與實際情況吻合度很好，能夠真實反映3項試驗措施與水稻產量的綜合關系。為了進一步明確各種因子的影響情況，對水稻產量回歸方程的偏回歸系數(shù)進行t檢驗和分析（表3），檢查與分析結果表明，大多數(shù)的偏回歸系數(shù)都達一定的顯著水平。

表3 偏回歸系數(shù)的t值檢驗Table 3 The t test of partial regression coefficient

2.2.3 不同農藝措施的效應分析

（1）單個農藝措施的效應

依據(jù)降維法可以分析出各因素與產量的關系，如果另外2個因素的編碼值接近零水平時，可以得出一個因素與水稻產量的偏回歸方程[11]，因3個自變量的二次項均為負值，可見3項措施與產量的函數(shù)關系呈彎曲度不同的開口向下的拋物線，出現(xiàn)極大值，其值過高或過低均不利于水稻的高產，其最高產量的x1為 0.3140 （24.85萬叢·hm-2），x2為 0.3287（純氮157.19 kg·hm-2），x3為-0.3225（32 d）。

（2）農藝措施之間互作效應分析

根據(jù)回歸方程分析結果可知，各個因素之間存在相互效應；插植密度x1與氮肥施用量x2互作關系不顯著（P＞0.05）。插植密度x1與秧齡x3存在顯著正互作效應（P＜0.05），說明水稻的秧齡短，早插生長期長，分蘗早且多，插植密度相對小些有利高產，秧齡長的，遲插分蘗發(fā)生遲且少，插植密度大些，也可獲得高產，以移栽較早，密度中等的產量為高。如果施氮量x2與水稻秧齡x3存在負互作效應（P＜0.01），說明水稻秧齡短的，早插本田生長期長，需要施用較多氮肥，才有利于高產；如果秧齡長的，本田生長期相應會短些，就不需要施用過多的氮肥。

（3）分析和確定高產栽培技術方案

為了尋找水稻高產栽培技術方案，采用統(tǒng)計選優(yōu)法，以水稻產量為目標函數(shù)進行分析。首先確定產量的預定指標，在限制不同條件下，3個因素分別取5個水平進行分析，并按照一定步長，在微機上模擬試驗，通過不斷改變步長和取值的范圍，一直到5個水平上不同的模擬值都達到預定目標時，就將該取值范圍設置為預定指標理想的取值區(qū)域[12]，再經(jīng)過微機模擬分析，產量≥8250 kg·hm-2的平均值：每公頃插24.00萬叢，施純N量 164.23 kg，秧齡29.5 d（表4）。

表4 每公頃產量 ≥8250 kg 措施分布范圍Table 4 Distribution range of factors when yield ≥8250 kg·hm-2

2.3 廣優(yōu)673稻瘟病抗性分析

廣優(yōu)673在福建省安溪縣引種示范種植，稻瘟病表現(xiàn)較強抗性。為了進一步分析其抗性的位點，利用稻瘟病抗性基因Pi2、Pi9和Pigm檢測標記，對廣優(yōu)673、日本晴、9311和CO39進行檢測分析。檢測結果顯示，對照感病材料日本晴、9311和CO39均沒有檢測到抗性基因標記條帶，而廣優(yōu)673檢測有稻瘟病抗性基因Pi2條帶（圖1）。結果表明，廣優(yōu)673的抗性很可能來源于Pi2基因的抗性。

圖1 抗稻瘟病基因的分子標記檢測Fig. 1 PCR analysis for rice blast resistance genes

3 討論與結論

3.1 廣優(yōu)673栽培技術分析

廣優(yōu)673產量水平高，尤其適合在中高海拔山區(qū)作中稻、單季稻種植。根據(jù)產量構成情況分析，該品種主要的增產因素是千粒重大，穗粒數(shù)較多，結實率較高。此外，廣優(yōu)673還表現(xiàn)耐寒性好，適合山區(qū)冷浸田種植；但是，該品種在某些性狀上還是存在一些不足，主要是稻米品質一般，堊白粒率較高，堊白度大，整精米率偏低，植株也相對偏高。

試驗結果表明，密度、秧齡、N肥用量3個因素對廣優(yōu)673的產量都會有影響，結合生產實際，廣優(yōu)673在福建省安溪縣作中稻種植，高產栽培應掌握每公頃插23.0萬叢左右，移栽秧齡為28～30 d，施純N量為165 kg·hm-2左右。同時兼顧其他配套的栽培技術，如稀播育壯秧，施足基肥，早施分蘗肥，促早生快發(fā)，中后期適量增施穗粒肥，并適時斷水烤田，促進籽粒成熟，才能更加有利于產量的形成，確保高產。

3.2 廣優(yōu)673稻瘟病抗性基因分析

廣優(yōu)673在2年的福建省區(qū)試中均表現(xiàn)較好的稻瘟病抗性，在安溪縣引種種植也表現(xiàn)較好的稻瘟病抗性。推測廣優(yōu)673稻瘟病的抗性表現(xiàn)不是由于栽培技術的影響和環(huán)境的影響，而是由于廣優(yōu)673自身遺傳因素。為了進一步鑒定廣優(yōu)673稻瘟病抗性基因來源，利用開發(fā)的分子標記進行檢測，結果表明廣優(yōu)673含有抗稻瘟病Pi2基因。

Chen等[13]研究表明Pi2 的抗譜很廣，對從中國收集的792個稻瘟小種中的絕大部分表現(xiàn)抗性，只有7.55%的小種能侵染攜帶Pi2 的親本C101A51。此外，Pi2 對來自13個國家的43個稻瘟病菌株中的36個表現(xiàn)抗性[14]。Pi2 屬于NBS-LRR類基因，含有2個內含子，長度分別是3839 bp 和116 bp，Pi2 編碼產物包含1032個氨基酸，屬于典型的抗病R蛋白[15]。Piz-t、Pi9、Pi2和Pigm互為Piz位點上的等位基因[7,16]。另外，我們已經(jīng)將安溪縣種植感病水稻品種的葉片取回，目前正在進行稻瘟病菌的分離，后期將利用分離的不同稻瘟病菌，對廣優(yōu)673和攜帶Pi2的單基因系進行接種，來進一步確定廣優(yōu)673的抗譜特征和抗性來源。

利用分子標記檢測表明廣優(yōu)673含有抗性基因Pi2，然而廣優(yōu)673可能還含有其他抗性基因。楊德衛(wèi)等[7]研究利用生物信息學分析表明，感病品種日本晴中含有523個稻瘟病抗性R基因。實際上，每個品種都含有多個抗病基因，有的品種含有抗性基因的數(shù)量多，有的數(shù)量少，有的品種含有抗性基因的抗譜廣，有的抗譜窄。鑒于目前稻瘟病抗性基因標記數(shù)量有限，本研究利用目前抗性較強的Pi2[15]、Pi9[17]和Pigm基因功能標記[16]，檢測廣優(yōu)673含有稻瘟病抗性基因Pi2，而不含有稻瘟病抗性基因Pi9和Pigm，推測廣優(yōu)673抗性可能來源于抗性基因Pi2。