邱稀木，朱曉華，邊文冀，王淑芳，孟 勇

[1. 江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2. 江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；3. 江蘇省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（南京），江蘇 南京 210017]

0 引言

【研究意義】林可酰胺（Lincosamide）類抗生素主要有林可霉素（Lincomycin）、克林霉素（Clindamycin）、吡利霉素（Pirlimycin），能抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成，對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和一些厭氧革蘭氏陰性菌有抗菌作用[1-2]。林可酰胺類抗生素主要運用于臨床和畜禽養(yǎng)殖上，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙2020年1、2號》，林可酰胺類抗生素藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的運用目前還沒有明確的指導(dǎo)屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖的非規(guī)范用藥。近年來，在漁用投入品的風(fēng)險篩查中，在某些改水類產(chǎn)品中檢測到林可酰胺類抗生素藥物成分，對水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來了一定的風(fēng)險隱患?！厩叭搜芯窟M展】目前，關(guān)于林可酰胺類藥物殘留的檢測方法比較多，如液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中的林可酰胺類獸藥殘留[3]、酶聯(lián)免疫分析方法測定牛肉雞肉豬肉魚肉中的林可酰胺類抗生素[4]、高效液相色譜法對林可霉素含量的測定[5]、林可霉素的磁免疫化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒及其應(yīng)用[6]等，但在河蟹樣品中林可酰胺類藥物的檢測方法還未見報道。其中，液相色譜法以保留時間作為定性標(biāo)準(zhǔn)，比較容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果，而且靈敏度不高[7]；化學(xué)發(fā)光法需要柱后衍生，操作的過程較為繁瑣，時間和人工成本高[7]。且河蟹的肝胰腺樣品油脂成分高存在基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以對樣品提取和凈化的方法要求會較高[8]。【本研究切入點】固相萃?。⊿PE小柱）主要用于從各類復(fù)雜的基質(zhì)提取出想得到的分析物，例如生物體（血液和尿液）、水樣[9]、土壤、藥材[10]中提取目標(biāo)分析物，達(dá)到濃縮或純化的目的。本研究將固相萃取小柱用于河蟹肝胰腺樣品的前處理，以期達(dá)到更好的提取和凈化效果，降低其他復(fù)雜基質(zhì)對樣品提取的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以3種林可酰胺類抗生素（林可霉素、克林霉素、吡利霉素）為檢測對象，將SPE固相萃取柱應(yīng)用于河蟹的獸藥殘留檢測前處理，以期建立河蟹中林可酰胺類抗生素獸藥殘留的快速檢測方法，對河蟹質(zhì)量安全管控具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試材料

1.1.1 儀器 QTRAP 4500三重四極桿（美國SCIEX公司，配備電噴霧離子源）；實驗室用水（Millipore系統(tǒng)超純水）；漩渦振蕩器（北京佳源興業(yè)公司）；Allegra TM 離心機（美國Beckman公司）；Turbo Vap濃縮工作站（瑞典Biotage公司）。

1.1.2 材料 甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，美國ROE公司）；有機濾膜（0.22 μm，天津津騰有限公司）；OASIS?HLB 6 ：500（mL：mg）固相萃取柱；3種林可酰胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科學(xué)研究監(jiān)測所，100 μg·mL-1）；河蟹樣品（從南京各農(nóng)貿(mào)市場隨機抽樣）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取5.0 mL林可酰胺、克林霉素和吡利霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別轉(zhuǎn)移至同一50.0 mL容量瓶中，用乙腈作為稀釋劑溶解并稀釋至一定體積。進一步將5.0 mL該溶液轉(zhuǎn)移至50.0 mL容量瓶中，用乙腈稀釋劑稀釋至一定體積。

1.3 樣品的提取和凈化

1.3.1 樣品提取 進行以下步驟：（1）將5 g河蟹樣品（蟹肉和蟹黃混合）稱量到離心管中；（2）加入配置好的2%甲酸乙腈15 mL；（3）使用漩渦振蕩器渦旋5分鐘使提取劑與樣品充分溶解；（4）將每管樣品在4 ℃下以9000 r·min-1的速度離心10 min；（5）離心后的上清液轉(zhuǎn)移到另一個50 mL離心管中；（6）殘留物用10 mL提取液再次提取，合并上清液。（7）溶液中加入5 mL正己烷，渦旋振蕩30 s，9000 r·min-1的速度離心5 min，棄去 上層正己烷，再加入5 mL正己烷重復(fù)操作一次。下層溶液待凈化。

1.3.2 樣品凈化 SPE小柱依次用6 ml甲醇和6 ml超純水以3 mL·min-1的流速進行預(yù)處理。將上清液（10 mL）以1 mL·min-1的速度通過固相萃取柱，棄流出液。10 mL超純水沖洗柱子，棄流出液，抽真空10 min。5 mL甲醇沖洗柱子洗脫。在40 ℃的條件下，洗脫液用氮吹儀吹至完全干，氮吹干后的殘留物加入1.00 mL 0.1%甲酸水-甲醇（9∶1）混合溶液，2分鐘渦旋使其充分混合，用針管吸取混合溶液，將溶液通過0.22 μm有機濾膜，置入棕色樣品瓶中，待上機。

1.4 色譜和質(zhì)譜分析條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：InfinityLab poroshell 120 SB-C18，（100 mm×2.7 mm，2.7 μm）；A相為0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇；柱溫：30 ℃；樣品量：10 μL；流速：0.40 mL·min-1；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Procedures of mobile phase gradient elution

1.4.2 質(zhì)譜分析條件 質(zhì)譜的電離模式為電噴霧離子源（ESI+模式）；輔助加熱氣體流量：50 L·min-1；霧化氣體流量：50 L·min-1；離子源的溫度為550 ℃；氣簾氣流量：35 L·min-1；噴霧電壓設(shè)置為5500 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑優(yōu)化

林可酰胺類抗生素極性較強，容易溶于極性溶劑[2,11]。因此，比較了磷酸鹽緩沖液、乙腈、乙酸乙酯和丙酮的萃取效率。結(jié)果表明，磷酸鹽緩沖液含水量高，不利于后續(xù)的濃縮，溶解的蛋白易導(dǎo)致過SPE柱時堵塞；乙酸乙酯作為萃取溶劑時，乳化現(xiàn)象嚴(yán)重，回收率很低；丙酮用作提取溶劑時揮發(fā)性很高，直接注入可能會破壞管道和質(zhì)譜組件[3]。乙腈是極性較強的有機溶劑，具有沉淀蛋白質(zhì)的作用，各指標(biāo)的回收率優(yōu)于其他提取劑。因此，本試驗選擇乙腈為提取溶劑。此外，分別以純乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈、1%氨水乙腈、2%氨水乙腈作為提取液，考察其對3種林可酰胺類目標(biāo)物的提取效果。結(jié)果顯示，相比其他組，2%甲酸乙腈作為提取溶劑時的平均回收率最高，3種林可酰胺類藥物的回收率為76.9%～102%，滿足期望結(jié)果回收率在75%以上。因此，本試驗提取樣品采用2%甲酸乙腈進行試驗。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

利用InfinityLab poroshell 120 SB-C18（100 mm×2.7 mm，2.7 μm）色譜柱在ESI+模式下，比較了在乙腈-水或甲醇-水流動相系統(tǒng)中3種林可酰胺類藥物的色譜結(jié)果。試驗結(jié)果是：甲醇-水流動相中3個目標(biāo)的峰值形狀和響應(yīng)優(yōu)于乙腈-水，且洗脫時間短，所以選擇了甲醇-水流動相系統(tǒng)。

通過在流動相中加入適量的揮發(fā)性鹽或酸可以提高目標(biāo)物的反應(yīng)值、分辨率和峰形[12-13]。因此，在水相中添加甲酸或乙酸銨對流動相系統(tǒng)做進一步優(yōu)化。離子化后3種目標(biāo)化合物主要以[M+H]+的形式存在[14-15]。結(jié)果是，在水相中添加醋酸銨降低了各目標(biāo)化合物的響應(yīng)值[16-18]；在水相中加入甲酸后，各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)提高了10%，且添加0.1%甲酸時效果最佳。因此本試驗使用0.1%甲酸水-甲醇作為流動相。

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

將50 μg·L-1待測林可酰胺標(biāo)準(zhǔn)混合溶液用針型泵注入質(zhì)譜儀，分別用電噴霧正電離模式和電噴霧負(fù)電離模式對藥物的母離子全掃描進行比較并優(yōu)化了碰撞能量和去簇電壓。分析結(jié)果表明，在電噴霧正電離模式下，3種測試對象的離子信號穩(wěn)定，響應(yīng)速度快，因此選擇電噴霧正電離掃描模式。在這種模式下，所有3種化合物都產(chǎn)生了[M+H]+的母離子。進一步掃描生成的子離子，選擇豐度最高的2個子離子進行定性和定量分析?？疾炝藝婌F電壓分別為：4500V、5000 V、5500 V時，3種標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子化效率，結(jié)果為5500 V時的離子化效率最高。目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析條件見表2。3種林可酰胺類抗生素藥物的總離子流圖見圖1。

圖1 質(zhì)量濃度為50 ng·L-1的 3 種林可酰胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of 50 ng·L-1standard solutions of 3 lincosamide antibiotics

表2 林可酰胺類藥物測定的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters for lincosamide antibiotics determination

2.4 SPE小柱對蟹黃的凈化效果

河蟹的肝胰腺富含碳水化合物、氨基酸、有機酸、蛋白質(zhì)、膠原蛋白、維生素A、不飽和脂肪酸等，這會影響目標(biāo)化合物的測定，并污染離子源[19-21]。因此，本試驗考察了在河蟹肝胰腺樣品提取中，固相萃取柱對3種林可酰胺類藥物的凈化效果和回收率。試驗分析了6種SPE小柱的凈化效果（圖2），其中OASIS?HLB 6 mL/500 mg SPE柱組的凈化結(jié)果最好。使用該型號SPE小柱，3種林可酰胺類藥物的回收率在80%以上，平均回收率是84.6%，明顯好于其他固相萃取柱組。因此，本方法最終選擇型號為OASIS?HLB 6 mL/500 mg的 SPE柱來凈化河蟹肝胰腺樣品。

圖2 不同固相萃取柱對目標(biāo)物回收率的影響Fig. 2 Recovery rates on 3 antibiotics by various SPE columns

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

電噴霧離子源在電離時候，樣品中的基質(zhì)和目標(biāo)化合物具有競爭關(guān)系，這種現(xiàn)象為基質(zhì)強化效應(yīng)或基質(zhì)抑制效應(yīng)[22-24]。本試驗考察了1、5、10、20、50、100 ng·mL-16個質(zhì)量濃度，建立對應(yīng)的直角坐標(biāo)軸，峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)。基質(zhì)效應(yīng)（ME）的計算公式為（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率）×100%[25-27]。使用6種固相萃取柱進行二次純化后，基質(zhì)工作曲線與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率之比均低于50%，表明具有顯著的基質(zhì)效應(yīng)。因此，本方法采用基質(zhì)匹配曲線對 3 種林可酰胺類抗生素獸藥殘留進行定量分析。相比于其他組，OASIS?HLB 6 ：500（mL：mg）固相萃取小柱可以有效降低河蟹肝胰腺樣品在液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀上的基質(zhì)抑制效應(yīng)。

2.6 試驗方法的評價

2.6.1 方法的線性范圍、檢測限和定量限 以0、1、5、10、20、50 ng·mL-1為質(zhì)量濃度水平，以峰面積Y和相應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)質(zhì)量濃度為X（μg·L-1），繪制出3種林可酰胺類抗生素的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性相關(guān)系數(shù)（R2）均高于0.99，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表3。將含有3種目標(biāo)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白河蟹樣品中，制備具有不同目標(biāo)物質(zhì)含量的加標(biāo)樣品。根據(jù)優(yōu)化條件測定樣品，分別采用3倍和10倍信噪比（S/N）的計算方法來確定方法的檢測限度和定量限度[28-29]。本檢測方法目標(biāo)物的LOD值約為0.3 μg·kg-1，LOQ值約為1.0 μg·kg-1（表3）。本方法的線性范圍能夠滿足實際河蟹肝胰腺樣品的檢測需要。

表3 方法的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear regression equation, correlation coefficient, detection limit, and quantitative limit of assay

2.6.2 方法的準(zhǔn)確性和精密度 將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到河蟹的空白樣品中，以獲得目標(biāo)質(zhì)量濃度為5.0、10.0和50.0 μg·kg-1的3個加標(biāo)水平，并根據(jù)優(yōu)化的方法重復(fù)測定6次。河蟹樣品中3種林可酰胺類抗生素的加標(biāo)回收率和精度見表4。3種質(zhì)量濃度的林可酰胺類抗生素在蟹類樣品中的回收率為80.5%～99%，相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為2.5%～5.2%，回收率和準(zhǔn)確度高，能夠滿足河蟹樣品中這3種林可酰胺類抗生素殘留的分析要求。

表4 3種林可酰胺類藥物的加標(biāo)回收率及精密度（n=6）Table 4 Recovery and precision of assay on 3 lincosamide antibiotics (n=6)

2.7 實際樣品分析

用本方法檢測了從各農(nóng)貿(mào)市場抽查到的170份河蟹樣品。結(jié)果5份河蟹樣品林可霉素含量檢出。檢出的陽性樣品林可霉素質(zhì)量濃度依次為：4.43 、9.23、4.26 、17.77 、8.47 μg·kg-1。本方法簡單、快捷、精確度高，適用于河蟹樣品中3種林肯酰胺類抗生素殘留的檢測，其中一份陽性樣品的色譜圖如圖3所示。

圖3 陽性樣品的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of positive samples

3 討論與結(jié)論

復(fù)雜的油脂基質(zhì)給河蟹蟹黃抗生素類藥物的檢測造成了一定的困難。油脂易溶于正己烷，正己烷和水分層，正己烷在上層，棄掉正己烷可達(dá)到凈化效果；HLB小柱吸附劑是由親脂性二乙烯苯和親水性n-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，其保留機理為反相，通過一個“特殊的極性捕獲基團”來增加對極性物質(zhì)的保留提供很好的水浸潤性，林可酰胺類抗生素藥物是極性較強的物質(zhì)，因此用HLB小柱提取該藥物。

針對河蟹肝胰腺基質(zhì)的特點，結(jié)合現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報道，本研究對傳統(tǒng)提取工藝進行了改進，以減少肝胰腺樣品中其他復(fù)雜基質(zhì)的干擾，使用2%甲酸乙腈作樣品的提取溶劑，凈化過程采用了正 己 烷 祛 脂 和OASIS?HLB 6∶500（mL∶mg）SPE柱進行過濾和富集，優(yōu)化了部分液相色譜和質(zhì)譜的分析程序等。采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了在河蟹肝胰腺樣品中林可酰胺類抗生素藥物殘留的快速測定方法。本方法具有步驟少、精確度高、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、減少溶劑的消耗量等優(yōu)點。本研究完善了對河蟹肝胰腺樣品中林可酰胺類獸藥殘留的定量檢測，可為河蟹的質(zhì)量安全生產(chǎn)監(jiān)控提供技術(shù)支持。