方少忠，郭文杰，鄭益平，張 潔，楊成龍，黃永旺，林智敏

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，福建 福州 350003；2. 福建省南平市延平區(qū)大橫鎮(zhèn)政府農(nóng)技站，福建 南平 354200）

0 引言

【研究意義】根際微生物種類(lèi)眾多，是連結(jié)植物根系與土壤的狹窄區(qū)域，是影響許多生物生長(zhǎng)的活躍界面，也是地球上最復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)之一[1]。根際的生物種類(lèi)主要包括細(xì)菌、真菌、卵菌、線蟲(chóng)、原生動(dòng)物、藻類(lèi)、病毒、古細(xì)菌和節(jié)肢動(dòng)物[2-3]。根際生物主要分為兩個(gè)類(lèi)群：其中一類(lèi)與植物健康生長(zhǎng)有關(guān)，主要是固氮菌、菌根真菌、促生菌、生防菌、真菌；另一類(lèi)是不利于植物健康生長(zhǎng)的根際生物，包括病原真菌、卵菌和細(xì)菌[4]。此外，土壤真菌在土壤養(yǎng)分循環(huán)與陸地生態(tài)系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[5]。一方面，植物的豐富度和植被蓋度直接影響了土壤真菌和真菌對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收[6]，另一方面土壤性狀，包括土壤理化性質(zhì)、土壤營(yíng)養(yǎng)成分和一些微量元素，有利于土壤以真菌為主的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成，即土壤真菌群落[7]。單一栽培品種在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中對(duì)真菌多樣性的影響是一個(gè)普遍現(xiàn)象[8-9]，連續(xù)種植的百合容易引起土壤真菌病害的發(fā)生[10]。百合通常3年種植才收獲或常年種植切花，容易產(chǎn)生土傳病害。已經(jīng)報(bào)道的百合真菌性病害有22種[11]，主要是枯萎病、灰霉病、葉枯病、根腐病，其中枯萎病屬真菌性的土傳病害，由尖孢鐮刀菌和茄腐鐮刀菌侵染引起，對(duì)百合植株的危害十分嚴(yán)重，很大程度影響了百合切花的質(zhì)量和產(chǎn)量[12]。因此通過(guò)土壤消毒方式，改變百合土壤真菌群落生態(tài)，從而防治百合真菌病害，具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)已應(yīng)用于土壤根際微生物的多樣性研究。研究學(xué)者以植物種質(zhì)根際細(xì)菌群落的分布以確定核心微生物的組成，通過(guò)焦磷酸測(cè)序16S rRNA分析土壤根際和內(nèi)生根室的細(xì)菌片段，獲得土壤不同類(lèi)型的群落[13]。2010年Bates等[14]選取146份土壤樣本，篩選出一套通用的引物幾乎區(qū)分開(kāi)所有的細(xì)菌和古生菌類(lèi)群。1990年White等[15]通過(guò)PCR方法擴(kuò)增真菌的ITS序列進(jìn)行聚類(lèi)分析。利用非化學(xué)手段處理作物土壤以降低真菌病害，已有相關(guān)報(bào)道。El-Gali等[16]對(duì)扁豆苗圃苗床土壤以熱水消毒，土壤的尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌和腐霉的繁殖體大大減少；張春怡[17]等采用熏蒸材料土壤消毒結(jié)合微生物菌劑處理，高通量測(cè)序顯示能顯著降低根際真菌Ace、Chao和Shannon指數(shù)，茄子黃萎病得到有效防控；胡洪濤等[18]采用棉隆消毒土壤，對(duì)甘藍(lán)根腫病的防效達(dá)91.56%，高通量測(cè)序結(jié)果有15個(gè)屬的真菌豐度發(fā)生顯著改變?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】采用高通量測(cè)序技術(shù)，探討土壤不同消毒方式對(duì)百合根際真菌群落的影響，篩選出抑制百合有害真菌病原且提高有益真菌的方法，尚待深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以福建南平延平百合基地根際土壤為研究對(duì)象，采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)真菌V3～V5區(qū)和ITS1區(qū)片段進(jìn)行測(cè)序，對(duì)根際土壤的真菌群落多樣性分析，結(jié)合田間棉隆、熱水和乙醇處理對(duì)應(yīng)的效果，獲得有效解決百合連作問(wèn)題的物理或化學(xué)途徑，并從分子水平揭示百合根際土壤真菌群落的多樣性和滋生特點(diǎn)，以期為百合根際土壤真菌的良性生態(tài)構(gòu)建提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)位于福建省南平市延平區(qū)王臺(tái)鎮(zhèn)羅源村南平市興一春百合園藝有限公司百合基地，屬中亞熱帶海洋季風(fēng)氣候，年均氣溫17.3 ℃，年降水量1669 mm。試驗(yàn)地土壤類(lèi)型為紅壤，0～10 cm土層的基本理化性質(zhì)：pH 5.2，有機(jī)質(zhì)15.3 g·kg-1，堿解氮66.1 mg·kg-1，速 效磷54.2 mg·kg-1，速效鉀269 mg·kg-1，全氮 800 mg·kg-1，全磷 450 mg·kg-1，全鉀 39.9 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地百合種球均經(jīng)過(guò)夏季采收后（5～7月）長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月的傳統(tǒng)漫灌淹浸過(guò)程，排水晾干，于2019年12月11日開(kāi)始種植（種植時(shí)間安排依據(jù)南平地區(qū)農(nóng)戶每年百合種球切花種植時(shí)間）。選取常年種植百合品種木門(mén)（ConcaD’or）的地塊，設(shè)置4個(gè)處理：①棉隆處理（F、J、N），每塊小區(qū)取98%棉隆微粒劑150 g與土壤攪拌均勻，覆蓋不透氣的塑料膜，用開(kāi)溝壓邊法（內(nèi)側(cè)壓土）密封好四邊，塑料膜覆蓋半個(gè)月后，再掀膜透氣半個(gè)月后再種球；②熱水處理（D、H、L），每塊地灌入50 ℃熱水后薄膜覆蓋保持土壤溫度；③乙醇處理（E、I、M），每塊小區(qū)噴施2%乙醇10 kg，用塑料膜覆蓋半個(gè)月后，再掀膜透氣；④對(duì)照組CK（G、K、O）。試驗(yàn)地四周設(shè)有保護(hù)行，每個(gè)處理3個(gè)小區(qū)，總共12塊小區(qū)，每塊小區(qū)1.2 m×3 m，隨機(jī)分布。種球圍徑14～16 cm，每個(gè)小區(qū)種植10行，每行9粒球，球間距15 cm，種植深度15 cm。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集 樣本采集于2020年1月、3月和4月，在4個(gè)不同處理組中進(jìn)行，按照五點(diǎn)取樣法，采集表層土壤（0～15 cm）共計(jì)1 kg左右，每個(gè)樣地設(shè)3個(gè)樣方。土壤取樣分為3個(gè)時(shí)期：1）幼苗期（D、E、F、G）：百合植株長(zhǎng)到10 cm左右進(jìn)行一次取樣；2）現(xiàn)蕾期（H、I、J、K）：百合植株開(kāi)始現(xiàn)蕾時(shí)進(jìn)行第二次取樣；3）成花期（L、M、N、O）：百合花苞開(kāi)始采摘時(shí)進(jìn)行第三次取樣。土壤樣品過(guò)4目篩后分成2份，保存于4 ℃冰箱。

1.3.2 DNA提取和Illumina測(cè)序 土壤微生物總DNA采 用PowerSoil Kit （MoBio Laboratories Carlsbad，CA, USA）試劑盒提取， DNA用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)分析（Thermo，USA)，質(zhì)量濃度為20 ng·μL-1，質(zhì)量合格的DNA儲(chǔ)存于-20 ℃用于后續(xù)分析。

1.3.3 序列分析和真菌鑒定 標(biāo)準(zhǔn)真菌ITS測(cè)序引物：上游引物ITS5F：5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′，下游引物ITS1R：5′-GCTGCGTTC TTCATCGATGC-3′。PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1） 2μL，ITS5F（ 10μmol·L-1）1μL，ITS1R（10 μmol·L-1）1 μL，DNA Template 2 μL，ddH2O 8.75 μL，Q5? High-Fidelity DNA Polymerase 0.25 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性98 ℃ 2 min；變性 98 ℃15 s，退火 55 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，25～30個(gè)循環(huán)；再延伸72 ℃ 5 min， 10 ℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物280 bp大小，PCR產(chǎn)物用VAHTSTM DNA磁珠純化（諾維贊，南京），并用Quant-iT PicoGreen dsDNA檢測(cè)試劑盒定量（Invitrogen，美國(guó)）對(duì)PCR產(chǎn)物在Microplate reader (BioTek，F(xiàn)Lx800)上進(jìn)行定量。

1.3.4 試驗(yàn)上機(jī)流程 整個(gè)上機(jī)流程包括PCR的擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物的混樣、純化，文庫(kù)的構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序流程由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。本試驗(yàn)中，基于Illumina MiSeqPE250測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序的方法對(duì)16S rDNA 高變區(qū)V3～V5區(qū)和ITS1區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。生物信息學(xué)分析依據(jù)QIIME22019.4。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

在相似性 97%的水平上對(duì) Tags 序列進(jìn)行聚類(lèi)（USEARCH，version 10.0），以測(cè)序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過(guò)濾 OTU，進(jìn)行組間差異顯著性（LEfSe）分析，alpha 指數(shù)、Beta 多樣性分析[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)百合幼苗期生長(zhǎng)發(fā)育的影響

如圖1所示，通過(guò)棉隆、熱水和乙醇處理，對(duì)幼苗期百合的生長(zhǎng)性狀觀察，與CK對(duì)照組（圖1d）相比，熱水處理（圖1c）植株生長(zhǎng)農(nóng)藝性狀較為一致，且株高最高，其次為乙醇（圖1b）和CK對(duì)照，而經(jīng)棉隆處理（圖1a）的百合在生長(zhǎng)的幼苗期生長(zhǎng)緩慢，受到棉隆的抑制。

圖1 不同處理百合幼苗期田間生長(zhǎng)性狀Fig. 1 Growth of Lilium seedlings after treatments

2.2 不同處理土壤真菌群落多樣性

如圖2所示，經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后，總共得到472440 條高質(zhì)量序列（每個(gè)樣品23488～59592條序列）（圖2a）， 410 個(gè)OTU（每個(gè)樣品 378～471個(gè)OTU），這些OTU歸屬于 13 個(gè)門(mén)，22 個(gè)綱，16個(gè)目，11個(gè)科，47個(gè)屬和85個(gè)種（圖2b）。

圖2 不同處理對(duì)百合真菌群落多樣性的影響Fig. 2 Effect of disinfection on fungal community diversity of Lilium rhizosphere soil

2.3 不同處理土壤真菌物種分類(lèi)統(tǒng)計(jì)

由圖3可看出，各組樣品優(yōu)勢(shì)菌屬主要分布在被孢霉門(mén)（Mortierellomycota）、子囊菌門(mén)(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(mén) (Basidiomycota) 、毛霉門(mén)（Mucoromycota）、絲足蟲(chóng)類(lèi) (Cercozoa) 、壺菌門(mén)(Chytridiomycota)、Aphelidiomycota、羅茲菌門(mén)（Rozellomycota）、浮霉菌門(mén)(Blastocladiomycota)、蛙糞霉門(mén) （Basidiobolomycota）和捕蟲(chóng)霉門(mén)（Zoopagomycota）。其中子囊菌門(mén)相對(duì)豐度最高，其次是擔(dān)子菌門(mén)。4個(gè)處理組分別都是子囊菌門(mén)＞擔(dān)子菌門(mén)＞被孢霉門(mén)，其中熱水處理組在成花期時(shí)被孢霉門(mén)增至20.94%，變化幅度最大；棉隆組在現(xiàn)蕾期和成花期時(shí)擔(dān)子菌門(mén)下調(diào)幅度最大。

圖3 不同處理土壤真菌的相對(duì)豐度Fig. 3 Relative abundance of fungi genera in soils

2.4 不同處理土壤間有差異的真菌物種分析

從圖4縱向聚類(lèi)結(jié)果看，不同處理在屬分類(lèi)水平上主要是青霉菌屬（Penicillium）、籃狀菌屬（Talaromyces）、沙蜥屬（Saitozyma）、海洋真菌（Westerdykella）距離較近，枝長(zhǎng)較短；緊密帚枝霉（Sarocladium）、球腔菌屬（Mycosphaerella）、核果褐腐病菌（Monilinia）、榛色鉤囊菌（Hamigera）距離較近，枝長(zhǎng)較短；綠藻源真菌（Acremonium）、被孢霉菌（Mortierella）距離較近；酵母屬（Remersonia）、嗜熱真菌屬（Mycothermus）距離較近；微囊菌屬（Microascus）、金孢屬（Chrysosporium）、寄生屬（Hypomyces）距離較近；月?tīng)顝濇呙梗–urvularia）、鐮刀菌（Fusarium）、闊足柄孢殼菌（Zopfiella）、麹菌（Aspergillus）距離較近；說(shuō)明這些菌群在各樣品中組成較相似。

圖4 不同處理組真菌差異物種相對(duì)豐度熱圖Fig. 4 Heat map of fungi relative abundance in soils

根據(jù) OTU 豐度進(jìn)行聚類(lèi)分析，評(píng)判百合不同發(fā)育時(shí)期在屬水平上群落結(jié)構(gòu)的差異性和相似性。結(jié)果表明，3個(gè)發(fā)育階段的優(yōu)勢(shì)菌群存在明顯差異。在百合幼苗期主要的優(yōu)勢(shì)菌是熱鏈球菌屬（Mycothermus）、酵母屬（Remersonia）、曲霉屬（Aspergillus）和子囊菌（Zopfiella）；現(xiàn)蕾期優(yōu)勢(shì)菌是海洋真菌（Westerdykella）、鉤囊菌（Hamigera）、鏈核盤(pán)菌屬（Monilinia）和鑲刀菌屬（Fusarium）；成花期優(yōu)勢(shì)菌是被孢霉屬（Mortierella）、寄生菌屬（Hypomyces）、金孢子菌屬（Chrysosporium）和微囊菌屬（Microascus）。此外，3個(gè)不同處理組之間在3個(gè)百合發(fā)育階段的菌群變化也較為明顯，其中棉隆處理菌群變化較大，后期主要是引起寄生菌屬（Hypomyces）、金孢子菌屬（Chrysosporium）和微囊菌屬（Microascus）的增加，在百合生長(zhǎng)期內(nèi)主要病原菌鑲刀菌屬（Fusarium）豐度一直維持在低水平，而益生菌酵母屬（Remersonia）同時(shí)受到抑制，豐度不斷下降；熱水處理后期被孢霉屬（Mortierella）、酵母屬（Remersonia）增加；乙醇處理后期主要是引起曲霉屬（Aspergillus）和子囊菌（Zopfiella）減少；空白對(duì)照組后期主要是子囊菌（Zopfiella）增加。

根腐病菌和青霉菌屬是引起百合地下根腐和基腐病的2個(gè)主要病原菌。高通量測(cè)序結(jié)果如圖5所示，3種處理和對(duì)照組之間百合主要的2種病原菌根的發(fā)生規(guī)律是不同的，2種病原菌占全部真菌比例（百分比）存在明顯差異。乙醇在各個(gè)階段中這2種病原菌的百分比含量基本保持不變，而CK組是隨著生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，2種病原菌也同樣滋生生長(zhǎng)，而熱水處理和棉隆處理組中2種病原菌隨著生長(zhǎng)發(fā)育不斷減少，尤其在成花期時(shí)基本消失。

圖5 3個(gè)不同生長(zhǎng)階段中2種主要病原菌的百分比變化Fig. 5 Changes on proportion of 2 major pathogens at 3 Lilium growth stages

2.5 基于OTUs的主坐標(biāo)分析及樣品間的NMDS分析

由圖6可知，進(jìn)一步基于樣本OTU水平的相異系數(shù)bray-curtis距離矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析表明，熱水、乙醇和棉隆處理組真菌群落結(jié)構(gòu)與CK差異顯著（P＜0.01），第一主成分解釋了群落結(jié)構(gòu)差異的53.2%，第二主成分解釋了群落結(jié)構(gòu)差異的20.1%（圖6a）；熱水處理組、乙醇處理組、棉隆處理組和CK組距離較遠(yuǎn)，相似性低，差異程度大（圖6b）；各處理均能顯著改變真菌群落結(jié)構(gòu)。

圖6 不同處理真菌菌群主坐標(biāo)及NMDS分析Fig. 6 Principal coordinates and NMDS analyses on fungal community under different treatments

3 討論與結(jié)論

百合作為一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的園藝植物，除了鮮花百合，還有食藥用百合。國(guó)內(nèi)百合種植主產(chǎn)區(qū)分布于福建、廣東、云南、甘肅及江西等地，各地隨著常年重茬，百合病害發(fā)生不斷擴(kuò)大，其中最為主要的是真菌性病害[20]。百合系列品種，不管是北方還是南方，通常種植在溫室大棚中，因多年連作，真菌病害相對(duì)嚴(yán)重，主要是絲核菌、疫霉菌和腐霉菌等[21]；此外，通過(guò)系統(tǒng)調(diào)查研究表明，福建省百合真菌病害（12種）主要包括炭疽病、灰霉病、曲霉病、枯萎病等[22]。由于真菌病害在發(fā)病潛伏期和初期在地上部很難通過(guò)肉眼觀測(cè)分析，因此百合通常連作障礙克服方法包括：農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治方法[23]，例如：采取倒茬輪作、土壤改良、生防菌和土壤消毒等措施進(jìn)行有效的防治研究。

研究表明，連作會(huì)影響設(shè)施栽培百合土壤中益生菌與致病菌群間的平衡關(guān)系，易形成連作障礙[24]。百合根際土壤微生物種類(lèi)和數(shù)量因其不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段和品種的差異而改變[25]。本文中通過(guò)真菌物種分類(lèi)分析表明，4個(gè)組別中土壤的優(yōu)勢(shì)菌在不同生育期都發(fā)生變化，尤其是熱水處理在百合成花期被孢霉門(mén)提高至20.94%，此外，棉隆處理在現(xiàn)蕾期和成花期擔(dān)子菌門(mén)下調(diào)最為明顯；2種病原菌（根腐病菌和青霉菌屬）隨著生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，在成花期階段不發(fā)生。同時(shí)熱水處理對(duì)百合植株的田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)最好，不僅生長(zhǎng)速度一致，而且幼苗期生長(zhǎng)快速，棉隆處理雖然后期對(duì)病原菌具有抑制作用，但幼苗期生長(zhǎng)緩慢，后期完全恢復(fù)，說(shuō)明棉隆的殘留致使前期植株生長(zhǎng)受到一定抑制。雖然先前研究對(duì)百合重茬的藥效試驗(yàn)結(jié)果也表明棉隆效果最佳[26]，但建議利用棉隆進(jìn)行克服連作障礙的處理，應(yīng)該還要考慮棉隆殘留影響和中后期益生菌等配合使用為優(yōu)。

土壤類(lèi)型是影響真菌種群的重要因素之一，對(duì)土壤真菌物種豐度、Alpha多樣性、Beta多樣性均有顯著影響[27]。相比于傳統(tǒng)的微生物平板培養(yǎng)法和生物標(biāo)記法等土壤微生物研究方法，高通量測(cè)序技術(shù)可以解決無(wú)法培養(yǎng)的土壤微生物菌群，覆蓋度更高，多樣性和豐富度更好[28]。通過(guò)土壤真菌群落多樣性分析表明，OUT數(shù)量、物種數(shù)目、真菌的多樣性和豐富度很高?？傉婢郝浯嬖诓町?，棉隆處理（F)最高，空白對(duì)照（G)次之，熱水處理與乙醇處理菌落數(shù)量差異不大。4個(gè)組別中子囊菌門(mén)相對(duì)豐度最高，是絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌群，其次是擔(dān)子菌門(mén)和被孢霉門(mén)。如熱水處理后期引起被孢菌屬增加，研究表明被孢霉菌株將可能顯著提高了土壤可溶性有機(jī)碳[29]；其次，酵母屬可能對(duì)土壤修復(fù)起一定的作用[30]，所以推測(cè)這些益生真菌滋生可能與熱水處理之間有一定的關(guān)聯(lián)。

本研究結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)百合土壤的不同方法處理，各組土壤根際微生物發(fā)生了顯著變化，除棉隆處理外，熱水處理和乙醇處理相對(duì)空白對(duì)照總菌群數(shù)減少。在真菌群落組成中，土壤根際真菌主要以子囊菌門(mén)為主，熱水處理不僅降低了有害菌（根腐病菌和青霉菌屬），而且提高了有益菌被孢霉門(mén)和酵母屬，促進(jìn)了百合在幼苗期的良好生長(zhǎng)，從研究角度上看，它是解決百合連作障礙的一條有效物理防治方法。但考慮到熱水處理在南方地區(qū)的田間推廣難度大，可操作性差，因此，建議棉隆應(yīng)充分解除殘留后，增施有益菌是最為有效快速解決連作障礙的方法。