李文云，羅 懌，王小柯，林 乾，韓秀梅，陳永濤，李金強

（貴州省農(nóng)業(yè)科學院果樹科學研究所，貴州 貴陽 550006）

類黃酮是柑橘中重要的多酚類次生代謝物[1-2]，如陳皮中的橙皮苷、柚皮蕓香苷、川陳皮素、橘皮素、5-羥基-6,7,8,3,4′-五甲氧基黃酮和3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮[3]，化州橘紅中的柚皮苷和野漆樹苷[4]，枳殼中的柚皮苷、新橙皮苷、枳屬苷等[5]，均具有較高的藥用價值。此類化合物以C6-C3-C6為基本骨架，通過中央3 碳鏈互相連結而成，主要包括異黃酮、黃烷酮、黃酮醇、黃酮和花青素等[6]，因其具有較強的抗氧化和清除自由基能力而被廣泛關注。

研究表明，柑橘類黃酮的生物活性功能可能與其抗氧化作用有密切關系[7-8]，如甜橙、柑和橘中含量豐富的具有較強抗氧化作用的橙皮苷；柚中含量豐富的柚皮苷對動脈粥樣硬化、心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、骨質疏松癥和風濕病等具有顯著療效[9-10]。研究表明，類黃酮主要通過抑制前列腺素的生物合成、抑制磷酸二酯酶活性、減輕組胺釋放等作用來發(fā)揮其藥理作用[11-12]。類黃酮對人體具有重要的生物學功能，但人體不能直接對其合成，必須通過食物才能獲得[13-14]。柑橘是人類膳食中類黃酮的主要來源之一，所以探究柑橘類黃酮積累特征具有十分重要的意義。

牛肉紅朱橘（CitrusreticulataBlanco.‘Niurouhong’）由朱紅橘（Citrus reticulata Blanco.‘Zhuhongju’）突變而來，是貴州省惠水縣優(yōu)良的地方品種，其果皮果肉因富含類胡蘿卜素而呈誘人的橘紅色[15-16]。牛肉紅朱橘成熟果實富含多種抗氧化物質[17]，但未見相關人員對果實發(fā)育過程中主要抗氧化物質類黃酮動態(tài)積累特征進行系統(tǒng)分析研究。本研究以貴州地方特色柑橘品種——牛肉紅朱橘為研究對象，利用超高效液相色譜串聯(lián)質譜儀（UPLC-MS/MS）檢測其果實不同生長發(fā)育階段果皮中黃酮變化水平、動態(tài)積累特征和含量差異，并對不同生長發(fā)育階段類黃酮等差異代謝物進行篩選，以期為后期類黃酮合成路徑上關鍵基因發(fā)掘以及功能性食品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

牛肉紅朱橘果實：采自貴州省惠水縣爛壩林場，于不同生長發(fā)育階段進行采樣，即花后150 d（N1）、花后180 d（N2）、花后200 d（N3）、花后220 d（N4）、花后240 d（N5）。每次采收30 個果實，采完后立即送往實驗室，用蒸餾水清洗干凈，剝離外果皮后用液氮速凍，貯藏于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

甲醇、乙腈和乙酸均為色譜純，購于德國默克公司。

1.1.2 儀器與設備

Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A 超高效液相色譜，Applied Biosystems 4500 QTRAP 串聯(lián)質譜，WatersACQUITYUPLCHSST3C18 色譜柱，DW-86L490超低溫冰箱，LyoLab 3000 冷凍干燥儀。

1.2 方法

1.2.1 類黃酮提取

取冷凍干燥后的果皮樣品研磨至細碎粉末，準確稱取100 mg 粉末，溶解于1.0 mL 70%的甲醇溶液中，振蕩混勻后于4 ℃冰箱中過夜，9 500 r/min 離心10min，移液槍吸取上清液，過0.22 μm 濾膜后待上樣。

1.2.2 類黃酮檢測

利用超高效液相色譜串聯(lián)質譜進行檢測。C18 色譜柱，配置ESI 渦輪離子噴霧接口，利用Analyst 1.6.3軟件處理質譜數(shù)據(jù)。

檢測方法：UPLC 設置參照Wang 等[18]的方法，水相為超純水（含0.04%乙酸），有機相為乙腈（含0.04%乙酸）。流動相A 為超純水（含0.04%乙酸），流動相B 為乙腈（含0.04%乙酸）。洗脫梯度為：0～11 min，由A∶B=95∶5 勻速線性梯度變化至A∶B=5∶95；11～12 min，A∶B=5∶95；12.1～15 min，A∶B=95∶5。流速為0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量5 μL，電噴霧離子源溫度550 ℃，質譜電壓5 500 V。色譜參數(shù)設置參照Chen 等[19]進行。

定性與定量分析：根據(jù)保留時間、質核比和代謝物數(shù)據(jù)庫，對質譜數(shù)據(jù)進行定性分析，利用三重四級桿的多反應監(jiān)測模式對代謝物進行定量分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

對類黃酮原始數(shù)據(jù)進行歸一化處理后，利用R軟件的偏最小二乘判別分析（Partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）模型繪制熱圖，并計算變量重要性投影值（Variable importance in project，VIP）。符合VIP≥1 且差異倍數(shù)≥2 或差異倍數(shù)≤0.5的物質為差異代謝物。利用KEGG 數(shù)據(jù)庫對類黃酮差異代謝物進行注釋。

2 結果與分析

2.1 牛肉紅朱橘果皮類黃酮組分分析

利用UPLC-MS/MS 檢測牛肉紅朱橘5 個不同生長發(fā)育階段的果皮，共得到206 種類黃酮；其中，N1和N2 階段共檢測到204 種，兩者均未檢測到矢車菊素-3-O-半乳糖苷和飛燕草素-3-O-乙酰葡萄糖苷；N3 和N5 共檢測到206 種；N4 檢測到205 種。檢測到的物質主要包括黃酮、異黃酮、黃酮醇、查耳酮、黃烷酮、花青素等，其中有54 種獲得KEGG 注釋ID。熱圖分析結果見圖1，從圖1 可以看出，5 個不同生長發(fā)育階段類黃酮含量存在明顯差異，N1 和N2 大部分類黃酮豐度較高，熱圖上表現(xiàn)為紅色，兩者聚在一起；而N3、N4 和N5 類黃酮豐度較接近，大部分類黃酮豐度較N1 和N2 低，在熱圖上表現(xiàn)為綠色，三者距離較。

圖1 不同生長發(fā)育階段牛肉紅朱橘果皮類黃酮相對豐度熱圖分析Fig.1 Heat map of flavonoid relative abundance in pericarp of‘Niurouhong’mandarin fruits at different development stages

2.2 牛肉紅朱橘果皮類黃酮差異代謝物篩選分析

通過對不同生長發(fā)育階段進行比較篩選到的差異物質信息見表1。N1 vs N2 篩選到11 個差異代謝物；N2 vs N3 篩選到的差異代謝物最多，共47 個代謝物；N3 vs N4 篩選到13 個代謝物；N4 vs N5 篩選到的差異代謝物最少，僅10 個。在果實生長發(fā)育期所檢測到的大部分類黃酮含量隨著果實逐漸成熟呈下降趨勢，僅少部分物質如根皮素、根皮苷、芹菜素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷等呈上升趨勢。N2～N3 是類黃酮含量變化的拐點時期，大部分物質如芹菜素、異野漆樹苷、香葉木苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、5,6,7,4’-四甲氧基黃烷酮等，在N2～N3 表達豐度急劇下降，隨后變化放緩，N2 vs N3 篩選到的差異物質也最多。

表1 牛肉紅朱橘果皮不同生長發(fā)育階段差異代謝物信息Table 1 Information on selected differential metabolites in pericarp of ‘Niurouhong’mandarin fruits at different development stages

N1 vs N2 篩選到的差異物質中橙皮素、4′,6-二羥基-5,7-二甲氧基黃烷酮、楊梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷等5 個差異物質含量減少，芹菜素-3-O-鼠李糖苷、金合歡素-7-O-蕓香糖苷、香葉木素-7-O-蕓香糖苷等6 個差異物質含量增加。N2 vs N3 篩選到的差異物質中芹菜素、金合歡素、李屬異黃酮等39 個差異物質含量減少，柚皮素-7-O-葡萄糖苷、根皮苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷等8 個差異物質含量增加。N3 vs N4 篩選到的差異物質中2,4,4′-三羥基查耳酮、5,7,8-三羥基-6-甲氧基黃酮、二氫槲皮素等11 個差異物質含量減少，山柰酚-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-半乳糖苷2 個差異物質含量增加。N4 vs N5 中橙皮素和柚皮黃素-3-O-（3-羥基-3-甲基戊二酸）-葡萄糖苷2 個差異物質含量減少，根皮素、芫花素和根皮苷等8 個差異物質含量增加。

續(xù)表1 牛肉紅朱橘果皮不同生長發(fā)育階段差異代謝物信息Continue table 1 Information on selected differential metabolites in pericarp of ‘Niurouhong’mandarin fruits at different development stages

續(xù)表1 牛肉紅朱橘果皮不同生長發(fā)育階段差異代謝物信息Continue table 1 Information on selected differential metabolites in pericarp of ‘Niurouhong’mandarin fruits at different development stages

KEGG 注釋分析結果（圖2）表明，N1 vs N2差異代謝物A 僅富集于類黃酮合成（Flavonoid biosynthesis）通路。N2 vs N3 差異代謝物B 主要富集于異黃酮（Isoflavonoid biosynthesis）、黃酮和黃酮醇（Flavonoid and flavonol biosynthesis）、次生代謝（Bios-ynthesis of secondary metabolites）等7 條通路。N3 vs N4 差異代謝物C 主要富集于黃酮和黃酮醇，以及苯丙烷生物合成（Biosynthesis of phenylpropanoid）等5條通路。N4 vs N5 差異代謝物D 主要富集在類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成和次生代謝生物合成3 條通路。以上4 組比較結果均涉及類黃酮生物合成通路，所占被注釋代謝物總數(shù)的比例也較高，為37.5%～50%。從注釋結果還可以看出N2 vs N3 涉及的代謝通路最多，也更為復雜。

圖2 牛肉紅朱橘果皮差異代謝物KEGG 注釋分類圖Fig.2 KEGG annotation analysis of differential metabolites in pericarp of ‘Niurouhong’mandarin fruits

3 討論與結論

類黃酮是一類重要的抗氧化物質，除了參與植物防御外，在人體健康方面也發(fā)揮著重要作用[20]。類黃酮生物合成來自于苯丙烷代謝途徑，前體物質香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 在查爾酮合酶（Chalcone synthase, CHS）和查耳酮異構酶（Chalcone isomerase,CHI）催化下形成重要中間產(chǎn)物柚皮素，隨后柚皮素和其衍生產(chǎn)物經(jīng)過一系列酶促反應，并在葡萄糖苷轉移酶、鼠李糖基轉移酶、?；D移酶、羥基轉移酶、甲基轉移酶等修飾下進一步糖基化、?；⒘u基化、甲基化形成穩(wěn)態(tài)苷類[21]。與類黃酮苷元相比，類黃酮形成穩(wěn)態(tài)苷類后能夠增加可溶性和穩(wěn)定性，有助于其代謝穩(wěn)態(tài)的調節(jié)、儲存、運輸，且更易為人體吸收和利用[22]。目前在柑橘中已被鑒定出的類黃酮超過80 種，包括黃酮類、黃烷酮類、黃烷醇類、花青素類等[8]。研究表明，不同類型柑橘類黃酮組成和含量存在較大差異，并表現(xiàn)出一定的種質特異性，如柚皮苷、新橙皮苷和枳屬苷等黃烷酮糖苷在柚、葡萄柚、枳等種質中特異積累，橙皮苷和柚皮蕓香苷在甜橙、柑、橘和檸檬等種質中特異積累[23-24]，多甲氧基類黃酮在寬皮柑橘中的含量較高[25]，黃酮和黃酮醇主要在檸檬和萊檬中積累[26]，花青素主要在血橙中積累[27]。

果實成熟是個復雜的過程，涉及多個生理生化性狀的變化，以及多個結構基因或調節(jié)基因的共同作用[28]。隨著牛肉紅朱橘果實成熟，外觀和風味發(fā)生顯著改變，果皮顏色由綠色轉變?yōu)殚偌t色，口感逐漸變甜，風味逐漸濃郁，視覺、味覺、嗅覺、觸覺等多個感官品質發(fā)生改變。而作為抗氧化評價重要指標的類黃酮，在果皮成熟過程中變化趨勢基本一致，大部分呈現(xiàn)下降的趨勢。田靜等[29]分析了化州柚發(fā)育時期柚皮苷含量變化結果表明，無論是果皮還是果肉，柚皮苷含量均隨果徑增大呈下降趨勢，與該研究結果一致；Chen 等[30]在研究暗柳橙、紅暗柳橙、清家臍橙等黃皮層生長發(fā)育期蕓香糖苷積累特征時也得出類似結果，即柚皮蕓香苷、橙皮苷、香風草苷等隨著果實成熟整體代謝趨勢降低。

本研究利用代謝組學原理和方法對果皮發(fā)育期（花后150～240 d）類黃酮代謝規(guī)律進行了研究，結果表明：成熟度對類黃酮組分和含量具有較大的影響。N1 vs N2 差異代謝物僅富集于類黃酮生物合成途徑；而在N2～N3 期（花后180～200 d）類黃酮表達豐度急劇下降。隨著果皮顏色由綠逐漸轉為黃綠相間，再到成熟時期的橘紅色，越來越多的差異代謝通路如黃酮、黃酮醇、次生代謝等被篩選到。本研究結果反映了牛肉紅朱橘果皮生長發(fā)育期類黃酮代謝物變化規(guī)律以及相關生物過程的協(xié)同性和復雜性。而參與這些生物過程的關鍵基因除了可能與類黃酮合成途徑上下游的黃酮合成酶（CHS、CHI、FNS）、類黃酮-3′-羥化酶（Flavo-noids-3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H）、鼠李糖基轉移酶（Rhamnosyltransferase，Rhat）、葡萄糖基轉移酶（Glucosyltransferase，Glct）等結構基因具有密切關系外，可能還受調節(jié)基因的單獨或協(xié)同調控[31]。但具體是哪些基因在牛肉紅朱橘類黃酮代謝過程中起關鍵作用，還有待后期從代謝調控、關鍵結構基因或調節(jié)基因著手進行深入挖掘和探索。