李鑫，王文艷

（煙臺大學新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心 分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室，山東 煙臺264005）

酯酶參與藥物的活化和解毒過程，與藥物的代謝密切相關(guān)，在體內(nèi)發(fā)揮重要作用，也是前藥設(shè)計主要考慮的因素。催化酯類、硫酯類和酰胺類藥物水解的酯酶可分為3類：A-酯酶、B-酯酶和C-酯酶。能夠有效水解有機磷[如對氧磷、甲氟膦酸異丙酯（沙林）和甲氟磷酸頻哪酯（梭曼）]的酯酶，被歸類為A-酯酶，對氧磷酶（paraoxonase，PON）就是典型的A-酯酶。被有機磷、氨基甲酸酯和有機硫化合物抑制的酯酶被歸類為B-酯酶，羧酸酯酶（carboxylesterase，CES）、芳基乙酰胺脫乙酰酶（arylacetamide deacetylase，AADAC）、丁酰膽堿酯酶（butyrylcholinesterase，BCHE）等為B-酯酶[1]。不水解有機磷酯類并受其抑制的酯酶被歸類為C-酯酶，羧甲烯丁烯羥酸內(nèi)酯酶就是C-酯酶[2]。2008—2018年，美國食品和藥品管理局（FDA）已批準上市30個前藥，占批準上市的小分子化合物的12%以上[3]。2020年，F(xiàn)DA批準3個前藥，約占批準上市的小分子藥物的8%，目前仍然有10個以上的前藥正處于臨床試驗階段，如NUC-1031、OBI-3424、BSM-582664等[4]。這些已上市的前藥中50%以上均是酯類前藥，F(xiàn)DA申報資料中報道約18個前藥經(jīng)酯酶水解發(fā)揮活性，包括CES、BCHE以及其他的非特異性酯酶。如2015年上市藥物艾沙康唑硫酸酯（esaconazole sulfate），主要通過血液中的BCHE水解為艾沙康唑發(fā)揮抗真菌作用，2017年FDA批準上市的telotristat etiprate是羧酸酯類前藥，羧基乙酯化目的是增加脂溶性來提高體內(nèi)的吸收。對于uridine triacetate、fesoterodine、gabapentin enacarbil這些經(jīng)非特異性酯酶水解發(fā)揮作用的前藥，目前尚不知具體參與代謝的酶，更加迫切地需要了解體內(nèi)參與藥物水解的酯酶，以探究聯(lián)合用藥時發(fā)生藥物間相互作用的可能性。

本文主要關(guān)注CES、AADAC、BCHE、PON在藥物代謝中的應用，對這幾種酯酶的組織分布、底物及特異性抑制劑和種屬差異進行總結(jié)，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 酯酶的組織分布

酯酶的獨特組織分布為設(shè)計用于組織靶向的前藥提供了巨大的機會，因此有必要了解體內(nèi)酯酶的分布，下文對人體內(nèi)主要的酯酶進行分述。

1.1 羧酸酯酶

CES是一類重要的絲氨酸水解酶家族，根據(jù)遺傳序列哺乳動物CES可以分為6個家族：CES1、CES2、CES3、CES4、CES5和 CES6[5]。 在 人 體中，CES1、CES2 mRNA在肝中高度表達；CES1 mRNA在心、胃、睪丸、腎、脾和結(jié)腸中表達量較少；CES2 mRNA在小腸中高度表達，在心、結(jié)腸中也有表達；CES3在腦、肝、結(jié)腸處表達；而對CES4、CES5在人體內(nèi)的研究較少。其中CES1、CES2在藥物代謝中起到重要的作用。CES存在于胞漿中[6]，CES1由567個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為62 521，以單體、三聚體、六聚體形式存在，主要在肝中表達，小腸中幾乎不表達。CES2由559個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為61 807，以單體形式存在，主要在小腸中表達，在肝、腎中也有表達[7]。

1.2 芳基乙酰胺脫乙酰酶

AADAC是一種微粒體絲氨酸酯酶，相對分子質(zhì)量約45 000，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔體側(cè)[8]，在人體內(nèi)主要在肝和胃腸道表達，膀胱中也有表達，在肺和腎微粒體中不表達[9-10]。

1.3 丁酰膽堿酯酶

BCHE的mRNA在人肝中表達量最高，其次是肺、腦、心、骨骼肌、胰腺和腎[11]；其蛋白主要位于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。BCHE在肝中以單體或二聚體的形式存在。此外，BCHE還存在于血漿中，是由在肝中合成的BCHE分泌到血液中，在血漿中以四聚體的形式存在，大部分的BCHE以單體形式存在[12]。

1.4 對氧磷酶

PON家族至少有3個成員，包括PON1、PON2和PON3。PON1是PON家族中發(fā)現(xiàn)最早，研究最多的成員，PON1定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔側(cè)，并在脂質(zhì)轉(zhuǎn)移中起作用[13]，PON1 mRNA僅分布于成人的腎、肝、結(jié)腸以及胎兒的肝，PON2在人體內(nèi)表達于除血漿外的組織，PON2 mRNA更廣泛地分布在成人的腦、心、腎、脾、肝、結(jié)腸、肺、小腸、肌肉、胃、睪丸、胎盤、唾液、甲狀腺、腎上腺、胰腺、皮膚和骨髓，以及胎兒的大腦和肝中[14]。PON1和PON3主要在肝中合成并分泌到血漿中，與高密度脂蛋白緊密結(jié)合[15]。PON基因產(chǎn)物血清PON在有機磷神經(jīng)毒劑解毒中起重要作用，其基因多態(tài)性與腦卒中、動脈粥樣硬化、冠心病及2型糖尿病發(fā)病等有密切關(guān)系[16]。

2 酯酶的底物

了解酯酶的底物，從底物的化學結(jié)構(gòu)出發(fā)，對不同酯酶底物的結(jié)構(gòu)進行規(guī)律總結(jié)，為前藥設(shè)計提供合理依據(jù)。表1總結(jié)了酯酶的代表性底物及藥代動力學參數(shù)，下面對不同酯酶水解的底物進行分述。

表1 酯酶代表性底物及藥代動力學參數(shù)Table 1 Representative substrates and kinetic parameters of esterase

2.1 羧酸酯酶

CES主要催化酯鍵、酰胺鍵、硫酯鍵等的水解。CES1偏向水解含有較小乙醇基和較大酰基的底物如氯吡格雷、哌替啶、奧司他韋及幾種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑如咪達普利、依那普利、特莫卡普利等，還包括海洛因與可卡因這類毒品[23]。同時CES1參與生理和病理過程，例如在脂質(zhì)代謝、膽固醇穩(wěn)態(tài)和脂肪肝疾病等中負責水解大量內(nèi)源性酯如膽固醇酯和三酰甘油。CES2偏向于水解含有較大乙醇基和較小?；牡孜锶缫亮⑻婵?、普拉格雷、卡培他濱、氟他胺、普魯卡因等[17]。CES2在肝臟中的表達和功能與幾種代謝性疾病密切相關(guān)，如肥胖癥和非酒精性脂肪性肝炎，負責水解三酰甘油和二酰甘油。CES的大部分底物是前藥，因此要考慮參與水解的酶的亞型。

2.2 芳基乙酰胺脫乙酰酶

Kurokawa等[24]研究發(fā)現(xiàn)，普拉格雷水解不僅是由人CES催化的，而且還由AADAC催化。因為CES1和CES2在犬腸中不表達，所以在犬的腸中AADAC主要參與水解。因此AADAC是藥物開發(fā)中需要考慮的一種重要酯酶。從AADAC底物的

化學結(jié)構(gòu)來看AADAC傾向于水解較大醇基和較小?；牡孜?，如氟他胺[17]、酮康唑、非那西丁[20]、利福平[21]和茚地普隆等。Fukami 等[25]比較了人AADAC和CES的底物特異性發(fā)現(xiàn)，氟他胺、二乙酸熒光素可以由AADAC和CES2共同水解，表明AADAC與CES2的底物有一定的重疊。

2.3 丁酰膽堿酯酶

BCHE以非?？斓乃俾仕舛□Ｄ憠A，還可水解丙酰膽堿、乙酰膽堿、苯甲酰膽堿、琥珀酰膽堿[26]，米拉貝隆、可卡因也是BCHE的底物。有研究者總結(jié)了經(jīng)人血漿酯酶水解的臨床相關(guān)化合物如伊立替康、間羥舒喘靈酯、氟司洛爾、醋酸甲基強的松龍等均可由BCHE水解[27]。

2.4 對氧磷酶

沙林是最為熟知的PON底物，毛果蕓香堿[22]也是PON1的底物。NM441是新喹諾酮羧酸抗菌劑NM394的前藥，Tougou等[28]研究鑒定NM441的水解酶為大鼠血清PON。糖皮質(zhì)激素γ-內(nèi)酯和環(huán)狀碳酸酯也是PON的底物。有報道認為，有機磷酸酯和乙酸苯酯可用作PON1的特異性底物；二氫香豆素是目前已報道的PON2底物，?；呓z氨酸內(nèi)酯可用作PON2的相對特異性底物；洛伐他汀、辛伐他汀和螺內(nèi)酯可作為PON3的底物[29]。

3 酯酶的抑制劑

在樣品收集、存儲和分析過程中，穩(wěn)定的含酯的前藥是成功開發(fā)和驗證分析物濃度以進行安全性和暴露評估的生物分析檢測方法的關(guān)鍵步驟。在方法開發(fā)階段盡早使用酯酶抑制劑，因此了解不同類型的酯酶抑制劑更有利于酯類前藥生物樣品分析方法的開發(fā)，表2對酯酶的特異性抑制劑進行總結(jié)，以下對不同類別的酯酶抑制劑進行分述。

表2 酯酶的特異性抑制劑及IC50值Table 2 Specific inhibitors of esterase and IC50 values

3.1 羧酸酯酶

CES是絲氨酸酯酶，因此它的酶活性可以被有機磷、二異丙基氟磷酸（DFP）、雙（4-硝基苯基）磷酸酯（BNPP）和苯甲基磺酰氟（PMSF）等一般的絲氨酸酯酶抑制劑所抑制。目前已報道：替米沙坦、尼群地平、辛伐他汀可以抑制CES1；非諾貝特、辛伐他汀、卡維地洛、地爾硫?、毒扁豆堿、洛哌丁胺可以抑制CES2[23]。除了以上藥物對CES有抑制作用外，常用的藥物賦形劑對CES也有抑制作用，如十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯氫化蓖麻油對CES1有抑制作用，而吐溫20對CES2有抑制作用。另外許多天然產(chǎn)物及結(jié)構(gòu)改造物對CES也有抑制作用：一些天然黃酮類化合物對CES1和CES2都有抑制作用[38-39]，石吊蘭素是CES1的抑制劑[40]，光甘草定對CES2有強烈的抑制作用[41]；齊墩果酸和熊果酸這2種五環(huán)三萜類化合物對CES1具有很強的抑制作用[42]。

3.2 芳基乙酰胺脫乙酰酶

DFP也是AADAC的抑制劑[43]。目前尚未發(fā)現(xiàn)AADAC的特異性抑制劑，但長春堿[17]對CES2和AADAC均有抑制作用，對CES1無明顯抑制作用。毒扁豆堿能有效地抑制CES2和AADAC，可作為AADAC的特異性抑制劑。

3.3 丁酰膽堿酯酶

BCHE也是絲氨酸酯酶，可以被DFP、PMSF抑制，但BNPP對BCHE的抑制效果不強。BCHE還可以被奎尼丁、樂果與各種有機氯和氨基甲酸酯農(nóng)藥所抑制[26]。金絲梅、連翹葉[44]等常用中藥提取物對BCHE也有一定的抑制作用。BCHE具有代表性的抑制劑有四異丙基焦磷酸亞胺（iso-OMPA）[45]、他克林[35]、溴吡斯的明、新斯的明、多奈哌齊[46]、班布特羅[47]。

3.4 對氧磷酶

PON受氯化汞和4-（羥基汞）苯甲酸鈉的抑制。因為PON需要鈣維持其活性和穩(wěn)定性，所以乙二胺四乙酸（EDTA）可以高度抑制PON。目前尚沒有為每個PON特定的抑制劑。

4 酯酶的種屬差異

在藥物開發(fā)中，實驗動物經(jīng)常用于預測代謝途徑并評估候選藥物的毒性，但有時藥物代謝酶的物種差異導致推測在人體內(nèi)的藥代動力學行為困難。在人、猴、犬、兔、大鼠和小鼠中，均存在著共同的BCHE和PON。BCHE存在于所有物種的血漿中，尚未報道有PON的組織分布中的物種差異，故本文主要討論了CES和AADAC的種屬差異，為臨床前研究選擇實驗動物、預測酯類前藥在人體的藥代動力學提供依據(jù)。

4.1 羧酸酯酶

人類的CES主要有6個亞型，CES1、CES2主要參與藥物的水解，人類CES1和CES2家族均只有一個亞型，但在嚙齒類動物中，ces1和ces2家族均存在多種亞型，表3為不同種屬中CES的組織分布。在大鼠中，ces1家族有5個亞型（ces1a、ces1b、ces1c、ces1d和 ces1f），ces2家族有 7個亞型（ces2a、ces2b、ces2c、ces2d、ces2e、ces2f、ces2g）；在小鼠中，ces1家族有8個亞型（ces1a、ces1b、ces1c、ces1d、ces1e、ces1f、ces1g、ces1h），ces2家 族 有 8個 亞 型（ces2a、ces2b、ces2c、ces2d、ces2e、ces2f、ces2g、 ces2h）[5]。在食蟹猴中，有3個ces1亞型（ces1a、ces1b和ces1c），3個ces2亞型（ces2a、ces2b和ces2c）。在大鼠肝中ces1的表達高于ces2，這與人類很相近[48]。然而食蟹猴ces1a mRNA在肝中的表達水平比ces1b高19倍，ces2a mRNA在肝中表達水平比ces2b高56倍，但ces2c在肝中不表達，在空腸和腎中表達[49]。在大鼠小腸中ces1與ces2均有表達，而人小腸不表達CES1，犬小腸內(nèi)無ces。此外，ces1在大鼠腎中表達，在小鼠腎中高表達，CES1在人腎中不表達。

表3 不同種屬羧酸酯酶組織分布Table 3 Tissue distribution of carboxylesterase in different species

Rudakova等[50]研究人、大鼠、小鼠血漿中的酯酶活性發(fā)現(xiàn)，人血漿中膽堿酯酶活性最高，CES活性可以忽略不計，但大鼠、小鼠血漿中ces活性最高，且小鼠ces活性高于大鼠，而犬血漿中缺乏ces[44]，從血漿中酯酶活性與種類來看，犬的血漿更接近于人[51]。在大多數(shù)實驗動物中，ces2主要在腸中表達，猴小腸中表達ces1和ces2；人、大鼠、小鼠小腸中只表達ces2，但酶的表達量有差異，比格犬小腸中無ces[52]。Igawa等[53]研究食蟹猴與人腸道水解酶的活性差異發(fā)現(xiàn)，食蟹猴中腸水解對普萘洛爾衍生物顯示對映選擇性水解，猴腸道ces2具有對映選擇性，選擇猴作為實驗動物來推測前藥在人體腸道內(nèi)的水解可能是不準確的，這種情況下可以通過同源性建模和對接模擬來預測底物可被CES2水解的程度，以提升對藥物代謝的預測能力。然而采用Caco-2細胞評價藥物在小腸的吸收能力時，由于Caco-2細胞主要表達CES1，與人腸道表達CES2相反，在評價經(jīng)CES代謝的前藥時其結(jié)果可能是不準確的，對此早期研究人員采用在Caco-2細胞中添加BNPP抑制CES來評價前藥的吸收能力，但此種方法不適用于高通量篩選。目前研究人員已建立了具有與人小腸相似的低表達CES1的新型Caco-2來評價前藥滲透性[54-55]，這將更加準確反映前藥在腸道的滲透性。Nishimuta等[56]研究幾種前藥的清除率時發(fā)現(xiàn)，在所研究的物種（猴、犬、大鼠）中，霉酚酸酯和替莫卡普利在猴肝細胞中的水解與人肝細胞最相似，大鼠與人的差別最大。對于低清除率的前藥，使用肝細胞來預測水解速率比較準確；對于高清除率的前藥，使用肝S9數(shù)據(jù)來預測可以減少差異。

抗血小板藥物維卡格雷處于臨床開發(fā)階段，經(jīng)過CES水解后再經(jīng)細胞色素（CYP）酶代謝為活性代謝物，研究發(fā)現(xiàn)其第一步水解主要由腸道酯酶CES2介導，Qiu等[57]研究維卡格雷在犬和大鼠體內(nèi)的藥代動力學發(fā)現(xiàn)，灌胃給藥后，維卡格雷經(jīng)水解后生成2-氧代氯吡格雷，由于人和大鼠在胃腸道具有相似的CES2，人腸中活性代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生可能與大鼠最相似。BMS-936561(αCD70_MED-A)是一種抗體-藥物結(jié)合物，MED-A是一種氨基甲酸酯前體藥物，由CES激活，形成MED-B，發(fā)揮其DNA烷基化活性[58]。體外血清穩(wěn)定性研究表明，αCD70_MED-A中氨基甲酸酯保護基團的水解效率遵循順序為小鼠>大鼠>猴子>犬、人。由于人血漿中沒有CES，犬與猴血漿與人類似，采用猴的藥代動力學參數(shù)和在犬中水解速率常數(shù)預測人體內(nèi)藥代動力學與臨床結(jié)果相一致。綜上所述，大鼠小腸ces特性與人較為相似，考慮血漿酯酶活性與水解速率則發(fā)現(xiàn)比格犬血漿更接近人，而猴肝中的ces 酶活性與人較為相似，故了解酯酶的種屬差異后，可以結(jié)合多個種屬的數(shù)據(jù)結(jié)果進行預測。

4.2 芳基乙酰胺脫乙酰酶

在人中，AADAC的mRNA在肝和胃腸道中高表達，在膀胱中中度表達，在腎和肺中不表達。在食蟹猴中AADAC在肝和腸中表達，在大鼠和小鼠肝臟中AADAC mRNA表達水平最高，其次是胃腸道和腎，但大鼠肝中AADAC表達水平為小鼠的1/10[49]，與雄性大鼠相比，雌性大鼠組織中AADAC 的mRNA表達高約1.5 ~ 3.0倍[10]。AADAC表達水平的性別差異在小鼠中未檢測到[59]。AADAC是導致人非那西丁水解的主要酶[20]，重組人和小鼠AADAC對非那西丁水解的催化效率高于大鼠AADAC[59]，而食蟹猴肝中非那西丁的水解活性顯著高于人。姜金方等[10]已報道，利福平不會被大鼠或小鼠的AADAC水解，也不會被犬AADAC水解[17]，也不會被食蟹猴AADAC水解，但利福平會被人的AADAC特異性水解[18]，在人血漿中檢測到利福平的水解代謝物25-去乙酰利福平[60]，在大鼠、兔血漿中未檢測到。因此，25-去乙酰利福平很可能是在人體內(nèi)形成的一種特殊代謝物。普拉格雷由人體腸道CES2水解，但在犬腸道可以水解，證明AADAC是參與犬腸道普拉格雷水解的酶[24]。在臨床前藥物開發(fā)研究中，對于AADAC的底物特異性與種屬差異要引起注意。

5 結(jié)語

為了改善藥物的一些不良因素如水溶性低、不良味道；或者改善藥代動力學上一些影響藥效發(fā)揮的因素如易降解、半衰期太長或太短、藥物透膜能力低、缺乏理想的特異性（靶向性）等，可以將藥物設(shè)計成前藥類型。對酯酶研究的深入，可以指導新藥的合理設(shè)計，特別是酯類前藥。本文總結(jié)了酯酶的分布、底物、抑制劑及種屬差異，期望對藥物設(shè)計特別是前藥設(shè)計方面提供思路，為藥物在不同種屬中的藥代動力學差異給出合理解釋。