蘇比努爾·阿不拉克，張莉

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院綜合內(nèi)四科，新疆 烏魯木齊 830054）

免疫治療已成為多種惡性腫瘤的有效抗腫瘤治療手段，包括免疫檢查點(diǎn)阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）療法和嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptors-modified T cells，CAR-T）療法等，但其存在應(yīng)答率低、靶點(diǎn)單一、副作用大、易復(fù)發(fā)等不足。隨著抗腫瘤免疫機(jī)制研究的深入，腫瘤新生抗原成為免疫治療研究的熱點(diǎn)。腫瘤新生抗原由腫瘤體細(xì)胞突變產(chǎn)生，在正常細(xì)胞中不表達(dá)，可激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答；其免疫原性高、抗腫瘤免疫持續(xù)時(shí)間長、不易耐受；其靶點(diǎn)是腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen，TSA），只殺傷腫瘤細(xì)胞，是一種個(gè)體化精準(zhǔn)細(xì)胞免疫治療。新生抗原疫苗相關(guān)研究顯示，基于RNA、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、合成長肽的新生抗原疫苗能誘導(dǎo)新抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)[1]。腫瘤新生抗原疫苗存在設(shè)計(jì)制備過程耗時(shí)長、成本高等缺點(diǎn)。目前，有關(guān)腫瘤新生抗原疫苗的研究，主要集中于候選分子的篩選及鑒定、可引起更強(qiáng)免疫應(yīng)答的疫苗設(shè)計(jì)方案及制備方式、與其他傳統(tǒng)治療方式聯(lián)用等。

1 腫瘤新生抗原的概念及免疫機(jī)制

1.1 腫瘤新生抗原的概念

基因突變會(huì)引起氨基酸序列的改變，氨基酸序列突變后的蛋白可能會(huì)在突變位置產(chǎn)生一個(gè)新的抗原表位，新生表位的抗原稱為新生抗原[2]。腫瘤抗原主要有腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA）和TSA 2種[3]。其中，TSA包括腫瘤新生抗原，中樞對(duì)腫瘤新生抗原沒有產(chǎn)生免疫耐受，故腫瘤新生抗原易于被免疫系統(tǒng)識(shí)別，產(chǎn)生T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。新生抗原在正常組織內(nèi)不表達(dá)，導(dǎo)致發(fā)生自身免疫疾病的概率低[4]。細(xì)胞周期依賴性激酶4（cyclin dependent kinase 4，CDK4）基因突變的產(chǎn)物是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤新生抗原[5]。

1.2 腫瘤新生抗原免疫機(jī)制

人體免疫系統(tǒng)有監(jiān)測能力，能激活機(jī)體對(duì)腫瘤的特異性免疫應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)并清除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，從而抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。國內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)，硝基化T細(xì)胞表位（NitraTh）可提高人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2， HER2）疫苗在C57BL/6小鼠和人源化NCG小鼠中的免疫原性，該團(tuán)隊(duì)將NitraTh與HER2的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域23 ~ 83融合產(chǎn)生的疫苗命名為HER2-NitraTh[6]。將該疫苗接種于異種移植模型小鼠上后可顯著抑制C57BL/6小鼠HER2陽性腫瘤細(xì)胞的生長，可見NitraTh增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫，并能抑制腫瘤生長，控制病情復(fù)發(fā)進(jìn)展。腫瘤新生抗原引起腫瘤免疫反應(yīng)的過程（見圖1）包括：組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）分子表達(dá)新生抗原；抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cells，APC）識(shí)別新生抗原，并進(jìn)行加工和呈遞；T細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）特異性識(shí)別新生抗原，并與其結(jié)合；T細(xì)胞活化并增殖分化為效應(yīng)T細(xì)胞，效應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)一步抑制腫瘤生長[5]。

圖1 腫瘤新生抗原的作用機(jī)制[7]Figure 1 Mechanism of action of tumor neoantigen

2 靶向新生抗原疫苗的種類及特點(diǎn)

2.1 DNA疫苗

DNA疫苗是一種基因疫苗（genetic vaccine），是將編碼TSA的DNA片段與質(zhì)粒DNA等載體通過基因工程技術(shù)結(jié)合后接種于個(gè)體，使個(gè)體表達(dá)特定抗原，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[8]。與其他疫苗相比，DNA疫苗的設(shè)計(jì)成本低，易于高純度規(guī)?；a(chǎn)，其穩(wěn)定性高、副作用較小，是較安全的可用疫苗[9]。

目前，針對(duì)惡性黑色素瘤的DNA疫苗研究較多。研究顯示，DC靶向趨化因子（MIP3α）與黑色素瘤抗原Gp100的融合可顯著增強(qiáng)小鼠黑色素瘤模型的免疫原性和存活率[10]。使用B16F10黑色素瘤同基因小鼠模型系統(tǒng)，并采用標(biāo)準(zhǔn)治療方案，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）評(píng)估疫苗特異性T細(xì)胞反應(yīng)，證實(shí)Gp100中加入MIP3α可以顯著提高小鼠模型免疫原性[11]。與單純抗原疫苗、非相關(guān)抗原疫苗和模擬疫苗相比，趨化因子融合疫苗可顯著減輕腫瘤負(fù)荷（tumor load），減緩腫瘤生長，并提高小鼠總生存率；與模擬疫苗相比，單純抗原和趨化因子融合疫苗誘導(dǎo)的CD4+T和CD8+T腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）水平顯著升高[12]。研究認(rèn)為，表達(dá)天然Endophilin-B2（EndoB2）的突變型Db/Sp244-252/R251H新表位的DNA疫苗能有效誘導(dǎo)接種小鼠的Db/Sp244-252/R251H特異性效應(yīng)子CD8+T細(xì)胞[13]。編碼腫瘤相關(guān)自我抗原的DNA疫苗已成功應(yīng)用于誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)[14]。

2.2 RNA疫苗

RNA疫苗也屬于基因疫苗，是將編碼TSA的外源基因?qū)雮€(gè)體內(nèi)，通過免疫系統(tǒng)合成TSA蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。RNA疫苗的制備原理與DNA疫苗相似。近幾年，信使RNA（messenger RNA，mRNA）疫苗遞送材料以及快速、規(guī)?；a(chǎn)mRNA疫苗是該領(lǐng)域主要研究重點(diǎn)。

Sahin等[15]在小鼠黑色素瘤組織中篩選出新生抗原，設(shè)計(jì)制備的RNA疫苗均具有抗腫瘤治療效果；該研究顯示，體外轉(zhuǎn)錄（in vitrotranscription，IVT）mRNA疫苗具有佐劑活性，不需要依賴其他佐劑可直接轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，該插入誘變的風(fēng)險(xiǎn)低、制備流程簡單。Sahin團(tuán)隊(duì)通過超聲引導(dǎo)的經(jīng)皮注射對(duì)晚期黑素瘤患者進(jìn)行mRNA疫苗注射免疫治療，該給藥途徑可增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率和新生抗原在DC上的呈遞，促進(jìn)DC的成熟，免疫后所有患者均能成功誘導(dǎo)出針對(duì)多種新抗原的強(qiáng)烈T細(xì)胞反應(yīng)[16]。

2.3 基于樹突狀細(xì)胞的疫苗

DC是抗原呈遞細(xì)胞之一，能激活CD4+T和CD8+T細(xì)胞[17]。目前，將DC增強(qiáng)宿主效應(yīng)和記憶CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的能力應(yīng)用于DC疫苗已成為腫瘤免疫治療的主要策略之一[18]。DC疫苗的毒性低，是一種相對(duì)安全的治療方法[19]。

Sipuleucel-T是美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性前列腺癌的全球首個(gè)全細(xì)胞DC疫苗[20]，其是由粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）及前列腺酸性磷酸酶融合蛋白（prostatic acid phosphatase，PAP）培養(yǎng)后分離獲得，是一種自體活細(xì)胞免疫療法；使用該疫苗患者總生存期可延長4.1個(gè)月。盡管DC疫苗具有增強(qiáng)效應(yīng)性和記憶性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的能力，但也面臨腫瘤微環(huán)境導(dǎo)致的免疫抑制以及單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞（MoDC）的功能限制等諸多挑戰(zhàn)。

2.4 納米疫苗

生物材料遞送系統(tǒng)可用于提高新生抗原肽疫苗或mRNA疫苗的療效[21]。把新生抗原肽與超pH敏感的聚合物組裝，可開發(fā)一種高響應(yīng)性納米疫苗，此類納米疫苗可響應(yīng)體內(nèi)酸堿環(huán)境變化，實(shí)現(xiàn)有效的胞質(zhì)遞送抗原增強(qiáng)交叉呈遞[22]。這種納米疫苗不含佐劑，載體聚合物本身可通過刺激cGAS-STING通路作為佐劑；通過調(diào)整聚合物側(cè)鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)，以獲得最佳的pH，在該pH條件下納米疫苗可以誘導(dǎo)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，其功效與含弗氏佐劑、Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）激動(dòng)劑等佐劑的疫苗相當(dāng)或更好。

有研究利用納米粒誘導(dǎo)較強(qiáng)免疫反應(yīng)，以及與CD40靶向配體相連等特性，制備納米疫苗，針對(duì)黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等進(jìn)行相關(guān)的臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示該納米疫苗能引起機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)[23-24]。Xu等[25]基于陽離子含氟聚合物制備的個(gè)性化納米疫苗，將含氟聚合物與模型抗原卵清蛋白混合形成的納米粒通過TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路誘導(dǎo)DC成熟，促進(jìn)抗原轉(zhuǎn)運(yùn)至DC的細(xì)胞質(zhì)中，引起系列免疫反應(yīng)。納米疫苗可抑制已建立的表達(dá)卵清蛋白的黑色素瘤，同時(shí)產(chǎn)生針對(duì)黑色素瘤的強(qiáng)大免疫記憶，為制備個(gè)性化癌癥疫苗以預(yù)防腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了一種簡單而通用的策略。Koh等[26]開發(fā)了以載有TLR激動(dòng)劑的納米乳劑為佐劑的腫瘤疫苗，該疫苗在皮下和原位小鼠肺癌模型中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的局部和全身抗腫瘤免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞活化并減輕T細(xì)胞耗竭，與抗程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）抗體聯(lián)合使用在消除腫瘤和延長存活時(shí)間方面顯示出協(xié)同作用。

3 靶向新生抗原疫苗的篩選

腫瘤新生抗原突變來自腫瘤基因組，基因組測序技術(shù)等方法可以協(xié)助識(shí)別與篩選腫瘤新生抗原。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行完整的外顯子組或轉(zhuǎn)錄組測序后，與健康對(duì)照組的基因組序列對(duì)比，可以篩選出腫瘤基因組中的非同義體細(xì)胞突變。使用針對(duì)MHC-抗原肽親和力的預(yù)測算法對(duì)突變進(jìn)行篩選與鑒定，進(jìn)而將免疫原性較高的候選新生抗原用于生產(chǎn)個(gè)體化新生抗原疫苗[27]。有部分預(yù)測算法可識(shí)別MHC I類分子的潛在高親和力結(jié)合劑，但是現(xiàn)有的預(yù)測方法并不能把MHC的穩(wěn)定性、遺傳因素、DNA的改變等全部影響因素包含在內(nèi)，技術(shù)仍需改進(jìn)[28]。

目前，研究已開發(fā)了包括pVACseq、TIminer、MuPeXI、Neopepsee等在內(nèi)的多個(gè)工具用于鑒定篩選候選新抗原，但鑒定結(jié)果假陽性率仍較高[29]。Yadav等[30]通過轉(zhuǎn)錄組、外顯子測序及質(zhì)譜分析等發(fā)現(xiàn)，小鼠腸癌細(xì)胞突變后的肽鏈可與MHCⅠ類分子結(jié)合，且該肽鏈上存在有免疫原性的突變新生表位，可作為新生肽疫苗的候選分子。因此，新一代測序技術(shù)與免疫及生物信息學(xué)技術(shù)可以提供鑒定腫瘤新生抗原的方法及思路。

4 靶向新生抗原疫苗的設(shè)計(jì)制備

在新生抗原疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，新生抗原主要通過交叉呈遞來識(shí)別[31]。APC被富集到接種位點(diǎn)后，活化的APC刺激外周免疫器官，誘導(dǎo)T細(xì)胞的激活[32]。在新生抗原疫苗的設(shè)計(jì)中，選擇能夠被有效提呈和識(shí)別的新生抗原是一項(xiàng)技術(shù)挑戰(zhàn)。除了免疫刺激成分外，不同佐劑和疫苗平臺(tái)也會(huì)影響疫苗的療效。

Ni等[33]開發(fā)的雙佐劑新生抗原納米疫苗（banNV），通過合成納米模板與陽離子多肽納米縮合，利用疏水性TLR激動(dòng)劑和ADP依賴葡糖激酶的物理負(fù)載制備。雙重協(xié)同佐劑能增強(qiáng)新生抗原的免疫原性，降低急性全身毒性。banNV與抗程序性死亡細(xì)胞蛋白（anti-programmed cell death protein 1，aPD-1）的組合能誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答，使70%的新生抗原特異性腫瘤完全消退而無復(fù)發(fā)[34]。banNV有望成為癌癥免疫治療高度個(gè)體化的新生抗原疫苗。高向東研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種靶向程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDL1）的二合一腫瘤疫苗，該疫苗能有效打破PDL1的免疫耐受，引發(fā)PDL1特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，重塑腫瘤微環(huán)境，該疫苗可能為PDL1抗體藥物不敏感患者提供可替代治療方案[35]。上述疫苗與雙佐劑結(jié)合的方式提高了疫苗的抗腫瘤能力，但要在臨床治療中使用仍需更深入的研究。

5 靶向新生抗原疫苗的臨床應(yīng)用

分子靶向藥物在大多數(shù)存在驅(qū)動(dòng)基因陽性的患者中具有良好效果，但易出現(xiàn)耐藥性。Carreno等[36]為經(jīng)單克隆抗體伊匹木單抗（ipilimumab）治療后的3位黑色素瘤患者靜脈接種新生抗原和DC的混合疫苗，研究證實(shí)新生抗原表位可使腫瘤特異性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)更廣泛和多樣化。部分臨床試驗(yàn)結(jié)果也支持這項(xiàng)研究結(jié)果，證明個(gè)體化腫瘤新生抗原疫苗方法的可行性[37]。杜學(xué)明團(tuán)隊(duì)報(bào)道1例化療及靶向治療后仍有進(jìn)展的肺鱗狀細(xì)胞癌患者，通過新生抗原疫苗治療后病灶明顯縮小[38]。Zaidi團(tuán)隊(duì)篩選并制備新生抗原疫苗PancVAX，該疫苗與其他免疫療法聯(lián)用比單用該疫苗抗腫瘤效果更好[39]。

在一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中對(duì)局部晚期及以上黑色素瘤患者接種新生抗原疫苗后，中位隨訪時(shí)間為25個(gè)月（范圍為20 ~ 32個(gè)月），其中4名患者未見復(fù)發(fā)，2名患者出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，經(jīng)4次抗PD-1抗體派姆單抗治療后病情得到緩解（派姆單抗治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的影像評(píng)估的緩解率為6.1%）[40]。另外，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤患者細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）單抗治療效果與該患者是否產(chǎn)生新生抗原表位以及新生抗原表位的產(chǎn)生數(shù)量密切相關(guān)[39-41]。McGranahan等[42]研究證實(shí)，PD-1單抗藥物對(duì)非小細(xì)胞肺癌的治療效果同樣與新生抗原表位有關(guān)聯(lián)性。因此，新生抗原疫苗可以單獨(dú)用于腫瘤治療，也可與佐劑結(jié)合增強(qiáng)免疫應(yīng)答。新生抗原疫苗與傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)治療、放療、化療聯(lián)用可延長患者生存期，與免疫檢查點(diǎn)抑制劑、靶向藥聯(lián)用可提高臨床治療療效，為患者提供真正意義上的個(gè)體化治療。

6 存在問題與展望

目前，已明確腫瘤新生抗原疫苗可引起CD4+T和CD8+T的免疫應(yīng)答，從而達(dá)到抗腫瘤目的。但CD4+T細(xì)胞表位與新生抗原相關(guān)免疫應(yīng)答之間的關(guān)系及其抗腫瘤機(jī)制尚不清楚。腫瘤新生抗原表位的結(jié)構(gòu)特征與其免疫原性強(qiáng)弱之間的聯(lián)系尚不明確；新生抗原預(yù)測算法、新生抗原的篩選鑒定方法及平臺(tái)仍需優(yōu)化。通常胃腸外注射的可溶性亞基抗原或分子佐劑由于分子小可迅速擴(kuò)散到全身循環(huán)系統(tǒng)中，但其僅有少部分在引流淋巴結(jié)中積累并引起有限的免疫反應(yīng)。皮下給藥的可溶性分子佐劑通常會(huì)引起明顯的全身炎性毒性。腫瘤新生抗原疫苗制備成本高、耗費(fèi)時(shí)間長。如何低成本、高效率、安全生產(chǎn)副作用小的疫苗是研究難點(diǎn)。腫瘤新生抗原疫苗的臨床療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)暫未完全統(tǒng)一。缺乏治療期間及結(jié)束后免疫監(jiān)測方法及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。雖然面臨諸多挑戰(zhàn)，仍有部分新生抗原疫苗設(shè)計(jì)制備成功并用于臨床治療，且療效顯著。相信隨著更深入的研究，更多患者將從基于新生抗原疫苗的個(gè)體化抗腫瘤治療中獲益。