李好文，葉國蒼，陳 川

（中國科學院大學深圳醫(yī)院<光明>結核門診 廣東 深圳 518000）

危害人類健康傳染病中結核病占據(jù)前位，為全球關注公共衛(wèi)生社會問題，為國內(nèi)重點控制重大疾病。我國每年新發(fā)結核患者人數(shù)為130 萬，僅次于印度，位居全球第2 位，為社會造成嚴重負擔[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，全世界中有1/3 結核病為北京基因型結核分枝桿菌引起[3-4]。作為一類具有相似遺傳背景結核分枝桿菌，可依據(jù)基因特征不同，將其分為許多亞型，并依次區(qū)分不同背景家族株成員[5-6]。我國作為北京基因型菌株高發(fā)地區(qū)，在北方地區(qū)比例高達70%～80%。具有高毒力特點，引起抑制和逃逸宿主免疫，耐藥性高，結核復發(fā)率高[6-7]。但往往各地研究不一致，為此，文章就深圳市光明區(qū)結核分枝桿菌的基因型分布特征及其利福平耐藥基因突變情況進行研究，為結核病防控提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取深圳市光明區(qū)中國科學院大學深圳醫(yī)院2017 年1 月—2019 年12 月結核病實驗室基因型毒株532 株，并采取羅氏比例法鑒定耐利福平臨床分離株24株及利福平敏感株474 株。

1.2 方法

羅氏培養(yǎng)基、RFP 藥敏培養(yǎng)基購自于珠海貝索生物技術有限公司。基因芯片法提取結核分枝桿菌耐藥基因，提取結核分枝桿菌DNA，0.9%氯化鈉溶液從羅氏培養(yǎng)基上洗脫結核分枝桿菌，80 ℃，30 min 滅火并離心3 000 r/min，10 min，去上清液，加入TE 懸液400 μL，煮沸30 min，12 000 r/min，3 min 取上清液，-20 ℃中保存?zhèn)錂z。分離培養(yǎng)菌株懸液20 μL，加入20 μL 結核分枝桿菌裂解液，混勻后并沸水浴10 min，1 000 r/min 離心2 min，留取上清液。PCR 反應管5 000 r/min 離心2 s，并添加已經(jīng)提取待測樣本DNA 4 μL。取兩管PCR 反應管，加入陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品DNA 4 μL，產(chǎn)品使用期間質(zhì)量控制PCR 按照以下條件進行擴增：50 ℃下2 min，95 ℃下10 min，95 ℃下45 s，68 ℃下60 s，30 個循環(huán)，95 ℃下30 s，54 ℃下30 s，68 ℃下60 s，30 個循環(huán)，68 ℃下10 min。依據(jù)說明書進行雜交、洗膜，結果判讀為陽性或陰性菌依據(jù)質(zhì)控品要求，依據(jù)顯色出現(xiàn)陣列，直接判讀是否出現(xiàn)突變。結核分枝桿菌基因分型檢測采取間隔區(qū)寡核苷酸分型。判定標準：典型性北京家族基因型：雜交信號點位1 ～34 為陰性，未出現(xiàn)黑色點，35 ～43 后9 個點位全為陽性者即全有黑色點出現(xiàn)。非典型性北京家族基因型：35 ～43 點位出現(xiàn)間斷或缺失信號，陽性信號黑點不少于5 個。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料用頻數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 424 株結核分枝桿菌臨床分離株基因型分析

利福平耐藥情況中，北京家族基因群為14 例，占比58.33%，非北京家族基因群為10 例，占比41.67%，見表1。

表1 424 株結核分枝桿菌臨床分離株基因型分析

2.2 利福平臨床分離株不同基因型的耐藥基因變異狀況

北京家族、非北京家族中單531、單516 中比較差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 利福平臨床分離株不同基因型的耐藥基因變異狀況[n（%）]

3.討論

目前，國內(nèi)結核病流行狀況嚴峻，耐藥及廣泛耐藥菌株出現(xiàn)為疾病診斷、治療造成挑戰(zhàn)。目前對結核分枝桿菌基因分型、耐藥關系有相關研究[8]。對不同地區(qū)而言，結核分枝桿菌基因型不同，由于我國地域廣闊，基因型分布情況相對復雜，北方地區(qū)中以北京基因型株為主要感染基因型，南方地區(qū)分布更為復雜[9-10]。深圳市作為靠海城市，目前對結核分枝桿菌基因分型及其耐藥關系之間研究較少。因此，分析深圳市結核分枝桿菌基因型分布情況以及利福平耐藥情況，對后續(xù)防控措施開展上起著重要作用[11]。

通過對深圳市光明區(qū)結核分枝桿菌分布情況得出，其中占比最高為北京家族基因群，北京家族基因群為14 例，占比58.33%，非北京家族基因群為10 例，占比41.67%。中國地區(qū)中，普遍流行為北京家族基因群，對江蘇、青海等其他地區(qū)研究證實，其北京家族基因群占比偏高。由于北京家族基因型病原菌毒力較強，易造成治療失敗以及復發(fā)。對其耐藥菌株檢測顯示，單531、單516 占比偏高，與非北京家族基因群比較，存在差異性（P＜0.05）。本次研究得出，北京基因型利福平耐藥變異絕對數(shù)量遠遠高于非北京型。但由于本次研究開展局限性，對其檢測變異位點數(shù)據(jù)及樣本含量存在一定局限，無法準確判斷出北京家族基因型是否更易出現(xiàn)耐藥基因型及耐藥率偏高。也無法證實北京家族所特有變異位點，仍需后續(xù)進一步深入研究。

綜上所述，深圳市光明區(qū)結核分枝桿菌中，北京家族、非北京家族基因群中基因多態(tài)性高，與利福平耐藥率無顯著相關，兩者在單531、單516 存在差異。