鄧雯婷，李加興，鄭建仙,*

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640；2.湖南省井礦鹽工程技術研究中心，湖南 長沙 410004）

甜味是人們偏愛的基本味。然而，以蔗糖為代表的甜味劑在發(fā)揮提供能量、改善質地、提升風味、抑菌防腐等重要作用時，容易產生令人不愉悅的甜膩口感，影響其他風味的釋放[1]。甜味抑制劑正是解決食品“過甜”問題的一類化合物[2]，在保持甜味劑有益功能特性的同時，降低它們對味蕾的甜味刺激。

2-(4-甲氧基苯氧基)丙酸（2-(4-methoxyphenoxy)propionic acid，HPMP，圖1）是目前應用最為廣泛的甜味抑制劑，在我國已經使用15 年之久。HPMP對于多種甜味物質均有顯著的甜味抑制作用[3]，不僅解決月餅、果醬、巧克力等傳統(tǒng)高糖食品甜度太高的實際難題，推動食品工業(yè)發(fā)展，還能有效改善高能食品和運動食品的食用品質，促進我國體育強國戰(zhàn)略的實現(xiàn)。HPMP作用迅速，持續(xù)時間短暫，并且在作用后的一段時間內，喝純水會有微甜的感覺[4]。但是，它也存在明顯的缺陷，在實際使用時可能影響某些食品的原有風味，在高添加量時也會伴隨異味刺激。

圖1 HPMP的結構圖Fig. 1 Structure of HPMP

因此，深入探究HPMP的構效關系，對于開發(fā)高強度、兼具更少異味的新型甜味抑制化合物，擴展其在食品工業(yè)生產的應用具有重要意義。但國內外目前對于HPMP的研究多集中于它的制備[5-6]和應用[7]，其構效關系有待闡明。有報道稱HPMP的對位取代對活性的影響頗為明顯[8]，對位基團的疏水性是其發(fā)揮甜味抑制作用的重要因素[9]。然而，其他疏水基團修飾對位后是否同樣具有甜味抑制作用，以及對位疏水基團的變化對抑制效果影響的相關研究卻比較空白。

甜味評價手段主要包括人群感官評價、鈣離子成像技術和電子舌味覺分析技術[10]。人群感官評價是最常用的味覺評價方法，卻極易受到參與者生理、心理等主觀因素的影響，不適用于安全性未知的物質。鈣離子成像技術通過甜味感應細胞中鈣離子的濃度變化來反映甜度，但如何構建穩(wěn)定表達甜味受體蛋白的細胞株是一大挑戰(zhàn)[11]。電子舌具有靈敏度高、準確性高和重復性好等優(yōu)勢，對樣品安全性要求不高，在甜味評價方面應用潛力巨大。楊陽等[12]利用電子舌準確區(qū)分5 種不同組成的甜菊糖，并且甜度識別結果與感官評定結果基本吻合。黃嘉麗等[13]研究顯示電子舌能夠實現(xiàn)蔗糖、安賽蜜、糖精鈉、新橙皮苷二氫查耳酮、柚苷二氫查耳酮多種甜味劑的甜度預測。另外，電子舌在掩味效果評價方面也有良好的應用，電子舌用于醫(yī)藥品的苦味遮蔽研究屢見不鮮[14-16]，但有關甜味抑制效果的電子舌評價方法鮮有報道。

本研究針對HPMP苯環(huán)對位進行修飾，合成HPMP及其衍生物（A1～A4），通過傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance，NMR）進行結構表征，建立甜味抑制效果的電子舌評價方法，分析HPMP及其衍生物的甜味抑制效果和自身呈味特征，探索HPMP的構效關系，以期為新型甜味抑制劑的開發(fā)和甜味抑制機理的完善提供可靠的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔗糖 河南萬邦實業(yè)有限公司；木糖醇、果糖、山梨糖醇 深圳鴻海食品科技有限公司；所有甜味劑均為食品級。

對甲酚、2-氯丙酸、對氯苯酚、4-丙氧基苯酚上海麥克林生化科技有限公司；4-甲氧基苯酚、4-乙氧基苯酚 上海阿拉丁生化科技有限公司；硫酸 廣州化學試劑廠；氫氧化鈉、碳酸氫鈉 福晨化學試劑有限公司；乙醇 天津富宇精細化工有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DT500A電子天平 常熟市意歐儀器儀表有限公司；SHA-C恒溫水浴振蕩器 江蘇省金壇市農儀器廠；pH-25 pH計 上海精密科學儀器有限公司；AVANCE III HD超導核磁共振波譜儀、VERTEX 33 FTIR儀 德國Bruker公司；SA402B電子舌 日本Insent公司。

1.3 方法

1.3.1 HPMP及其衍生物的合成

HPMP及其衍生物A1～A4的合成路線如圖2所示。具體操作參照文獻[6,17]并稍作修改，在250 mL圓底燒瓶中加入20 mmol 4-甲氧基苯酚和40 mmol氫氧化鈉，用30 mL無水乙醇溶解，隨后緩慢滴加22 mmol 2-氯丙酸，85 ℃回流反應5 h。反應結束后，50 ℃旋蒸除去乙醇。將產物倒入70 mL蒸餾水中，滴加6 mol/L硫酸溶液，調節(jié)溶液pH值為2，析出固形物。將所得固形物溶于飽和碳酸氫鈉溶液，過濾除去不溶性雜質，用6 mol/L硫酸溶液再次酸化濾液，調節(jié)溶液pH值為2，收集析出的結晶并用體積分數(shù)20%乙醇溶液重結晶，過濾并在50 ℃干燥后得到目標產物HPMP。HPMP衍生物A1～A4的合成方法同上。

圖2 HPMP及其衍生物A1～A4的合成路線Fig. 2 Synthetic routes of HPMP and its derivatives A1-A4

1.3.2 FTIR分析

稱取5 mg目標化合物，經溴化鉀壓片處理后，進行FTIR掃描，掃描范圍為4 000～500 cm－1。

1.3.3 NMR分析

稱取20 mg目標化合物，用0.6 mL氘代氯仿充分溶解，于室溫條件下進行1H-NMR、13C-NMR分析。1H-NMR、13C-NMR共振頻率分別為600、151 MHz。

1.3.4 感官評價

參考文獻[18]稍作修改，將甜味劃分為5 級，配制不同質量濃度的蔗糖溶液作為參比樣品，每個等級對應的甜度值和蔗糖溶液質量濃度見表1。從本課題組所在學院的研究生中招募15 名志愿者（6 名男性、9 名女性）組成感官評價小組，所有志愿者在實驗前1 h不得進食。取10 mL待口嘗樣品溶液于透明口嘗杯。實驗前，志愿者將參比樣品溶液含于口中10 s，期間做漱口動作，使舌頭充分感受甜味，記下該參比樣品溶液對應的甜度值，吐出，用蒸餾水漱口至少4 次，休息30 s后口嘗下一個參比樣品溶液。志愿者按照上述方法對待測樣品進行口嘗，根據(jù)口嘗感受，結合參比樣品液的甜度值，給出待測樣品的口嘗甜度。

表1 甜度值與對應的蔗糖溶液質量濃度Table 1 Sweetness scores and corresponding concentrations of sucrose solutions

1.3.5 電子舌分析

本研究所用的SA402B型電子舌傳感器陣列由6個味覺傳感器和3 根玻璃管參比電極構成[19]，各傳感器代表的味覺信息見表2。正式測試前，傳感器需進行活化、自檢以確保數(shù)據(jù)的可靠性和穩(wěn)定性。甜味和酸味、苦味、澀味、鮮味、咸味分開測試。測試甜味時，所有樣品重復測試5 次。測試其他味覺時，所有樣品重復測試4 次。根據(jù)韋伯-費希納定律，電子舌系統(tǒng)將測得的電勢信號轉化為對應的味覺值。

表2 各味覺傳感器代表的味覺信息Table 2 Taste information represented by various taste sensors

1.3.5.1 電子舌甜味抑制效果評價方法的建立與驗證

以蔗糖為研究載體，配制質量濃度15 g/100 mL蔗糖溶液，分別添加終質量濃度分別為0、50、75、100、125、150、200、250 mg/L的HPMP，進行電子舌甜味測定和感官評價，建立甜味抑制效果的電子舌評價方法。

以木糖醇為研究載體，配制質量濃度15 g/100 mL木糖醇溶液，分別添加終質量濃度0、50、75、100、125、150、200、250 mg/L的HPMP，進行電子舌甜味測定和感官評價，驗證電子舌甜味抑制效果評價方法的合理性。

1.3.5.2 HPMP及其衍生物的甜味抑制效果評價

選取4 種常用甜味劑蔗糖、果糖、木糖醇、山梨糖醇，評估HPMP及其衍生物A1～A4的甜味抑制效果。分別配制質量濃度15 g/100 mL蔗糖溶液、果糖溶液、木糖醇溶液、山梨糖醇溶液，依次添加終質量濃度分別為0、100、200 mg/L的HPMP和衍生物A1～A4，進行電子舌甜味測定。

1.3.5.3 其他味覺指標測定

配制質量濃度為200 mg/L的HPMP、化合物A1～A4溶液，使用電子舌對HPMP及其衍生物A1～A4的酸味、苦味、澀味、鮮味、咸味5個味覺指標進行測定。

配制質量濃度15 g/100 mL蔗糖溶液各6 份，其中1 份作為空白處理組，另外5 份分別添加終質量濃度為200 mg/L的HPMP、衍生物A1～A4，測定上述5個味覺指標。

1.3.6 甜味抑制效果評價指標測定

感官評價以口嘗甜度抑制率為評價指標，考察HPMP及其衍生物A1～A4對甜味劑口嘗甜度的抑制作用，口嘗甜度抑制率的計算如式（1）所示。將甜味傳感器輸出的味覺值稱為電子舌甜度，電子舌分析以電子舌甜度抑制率為評價指標，考察HPMP及其衍生物A1～A4對甜味劑電子舌甜度的抑制作用，電子舌甜度抑制率的計算如式（2）所示。

式中：Ia為未添加甜味抑制化合物的口嘗甜度；Ib為添加甜味抑制化合物的口嘗甜度。

式中：Ic為未添加甜味抑制化合物的電子舌甜度；Id為添加甜味抑制化合物的電子舌甜度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用MestReNova 12.0軟件進行NMR譜圖解析。采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，使用Ducan檢驗進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 2018軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 目標化合物的結構表征

HPMP：白色晶體，F(xiàn)TIR（KBr）v/cm－1：2 950、1 715、1 222、1 043、822。1H NMR（600 MHz，CDCl3）：δ6.88～6.81（m，4H，－Ar－H）、4.70（q，1H，J=6.8 Hz，－CH）、3.77（s，3H，－OCH3）、1.63（d，3H，J=6.9 Hz，－CH3）。13C NMR（151 MHz，CDCl3）：δ177.55（C=O）、154.77（Ar）、151.22（Ar）、116.72（Ar）、114.80（Ar）、73.25（CH）、55.69（OCH3）、18.45（CH3）。

2-(4-乙氧基苯氧基)丙酸（衍生物A1），白色晶體，F(xiàn)TIR（KBr）v/cm－1：2 975、1 715、1 220、1 045、819。1H NMR（600 MHz，CDCl3）：δ6.87～6.80（m，4H，－Ar－H）、4.70（q，1H，J=6.9 Hz，－CH）、3.98（q，2H，J=7.0 Hz，－OCH2）、1.63（d，3H，J=6.9 Hz，－CH3）、1.39（t，3H，J=7.0 Hz，－CH2CH3）。13C NMR（151 MHz，CDCl3）：δ177.20（C=O）、154.15（Ar）、151.08（Ar）、116.73（Ar）、115.48（Ar）、73.29（CH）、63.95（OCH2）、18.43（CH3）、14.89（CH3）。

2-(4-丙氧基苯氧基)丙酸（衍生物A2），白色晶體，F(xiàn)TIR（KBr）v/cm－1：2 966、1 717、1 221、1 045、825。1H NMR（600 MHz，CDCl3）：δ6.87～6.80（m，4H，－Ar－H）、4.70（q，1H，J=6.8 Hz，－CH）、3.87（t，2H，J=6.6 Hz，－OCH2）、1.82～1.75（m，2H，－OCH2CH2）、1.63（d，3H，J=6.9 Hz，－CH3）、1.02（t，3H，J=7.4 Hz，－CH2CH3）。13C NMR（151 MHz，CDCl3）：δ177.42（C=O）、154.36（Ar）、151.06（Ar）、116.72（Ar）、115.49（Ar）、73.29（CH）、70.07（OCH2）、22.64（CH2）、18.44（CH3）、10.52（CH3）。

2-(4-氯苯氧基)丙酸（衍生物A3），白色晶體，F(xiàn)TIR（KBr）v/cm－1：2 993、1 715、1 225、1 043、825。1H NMR（600 MHz、CDCl3）：δ7.26～7.22（m，2H，－Ar－H）、6.84～6.80（m，2H，－Ar－H）、4.75（q，1H，J=6.9 Hz，－CH）、1.66（d，3H，J=6.9 Hz，－CH3）。13C NMR（151 MHz，CDCl3）：δ177.81（C=O）、155.81（Ar）、129.58（Ar）、126.90（Ar）、116.48（Ar）、72.31（CH）、18.38（CH3）。

2-(4-甲基苯氧基)丙酸（衍生物A4），白色晶體，F(xiàn)TIR（KBr）v/cm－1：2 996、1 712、1 224、1 043、807。1H NMR（600 MHz，CDCl3）：δ7.10～7.05（m，2H，－Ar－H）、6.82～6.76（m，2H，－Ar－H）、4.75（q，1H，J=6.9 Hz，－CH）、2.28（s，3H，－CH3）、1.64（d，3H，J=6.9 Hz，－CH3）。13C NMR（151 MHz，CDCl3）：δ178.06（C=O）、155.04（Ar）、131.33（Ar）、130.11（Ar）、115.08（Ar）、72.24（CH）、20.50（CH3）、18.44（CH3）。

2.2 基于電子舌的甜味抑制效果評價方法的建立與驗證

基于人工脂膜技術，電子舌可以模擬人的口腔味蕾對不同類型甜味物質的感知[20]。利用電子舌法和口嘗法分析不同質量濃度的HPMP對蔗糖甜度的影響，結果見圖3A。由圖3A可知，隨著HPMP質量濃度的增加，HPMP對蔗糖的電子舌甜度和口嘗甜度的抑制作用逐漸增強，這一發(fā)現(xiàn)與HPMP競爭性抑制的機制[21]相符，電子舌在一定程度上可以反映HPMP的甜味抑制規(guī)律。為進一步驗證甜味抑制效果的電子舌評價方法的可行性，選取與蔗糖甜度相當?shù)哪咎谴甲鳛樘鹞遁d體，測定不同質量濃度HPMP的電子舌甜度抑制率和口嘗甜度抑制率，結果如圖3B所示。在實驗質量濃度范圍內，HPMP同樣抑制了木糖醇溶液的電子舌甜度，抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性，并且電子舌甜度抑制率和口嘗甜度抑制率的變化趨勢相對一致。在電子舌抑制苦味效果評價研究中，甜味劑類苦味抑制劑會通過占據(jù)苦味物質在傳感膜上的結合位點，導致電子舌對苦味物質的不敏感[22]，推測HPMP以相同的原理降低甜味劑的電子舌甜度。對于2 種甜味劑，感官評價的測定值誤差明顯偏大，提示電子舌用于甜味抑制效果評價具有更高的精確度。對電子舌甜度抑制率和口嘗甜度抑制率進行相關性分析，二者具有良好的線性相關性（P＜0.01），對于蔗糖和木糖醇，電子舌結果和口嘗結果的決定系數(shù)分別為0.969、0.983。綜上，電子舌法和感官評價法對HPMP的甜味抑制效果的評價基本等效。電子舌有望代替人工感官成為科學、客觀的甜味抑制效果評價手段，可為后續(xù)甜味抑制研究提供重要借鑒。

圖3 不同質量濃度的HPMP對蔗糖（A）和木糖醇（B）的甜味抑制作用Fig. 3 Sweetness inhibitory activities of HPMP at different concentrations on sucrose (A) and xylitol (B)

2.3 HPMP及其衍生物對甜度的影響

圖4A～D分別為HPMP及其衍生物對蔗糖、果糖、木糖醇、山梨糖醇電子舌甜度的影響。如圖4所示，針對HPMP苯環(huán)對位進行不同的疏水性基團修飾后，其衍生物對4 種甜味劑仍展現(xiàn)出一定的甜味抑制作用，而且隨著添加量的增加，各化合物的甜味抑制效果愈加明顯。衍生物A1～A4對果糖、木糖醇、山梨糖醇的電子舌甜度抑制率相對較低，可能是電子舌對甜味物質的敏感程度不同所致。黃嘉麗等[13]研究顯示等甜度不同類型甜味劑的電子舌甜味值會存在較大差異。因此，目前無法通過電子舌甜度抑制率直接比較同一甜度抑制化合物對多種甜味劑的抑制作用。

圖4 HPMP及其衍生物A1～A4對4 種甜味劑的電子舌甜度的影響Fig. 4 Effects of HPMP and its derivatives A1-A4 on electronic tongue sweetness intensity of four sweeteners

研究表明HPMP的疏水性會阻礙甜味受體對甜味物質的識別，進而達到降低甜度的目的[23]。嘗試以疏水性更強的基團替代對位的甲氧基，當不同的烷氧基修飾苯環(huán)對位時，在實驗質量濃度下，對于4 種甜味劑的甜味抑制程度均為：甲氧基＞乙氧基＞丙氧基，甜味抑制作用隨對位基團疏水性的增強反而減弱，丙氧基的修飾對甜味抑制作用的不利影響尤為明顯，這一發(fā)現(xiàn)與Acree等的研究結論[24]相符。以其他疏水性更強的基團修飾對位時，甲基修飾的A4和氯原子修飾的A3的甜味抑制效果與HPMP相近。對于蔗糖，在實驗質量濃度下，A3、A4的甜味抑制率均高于HPMP，但在抑制效果方面無顯著性差異；對于果糖，在低添加量時，HPMP的甜味抑制效果顯著強于A3、A42 種衍生物（P＜0.05），抑制作用程度為：HPMP＞A4＞A3，但隨著添加量的提高，三者的甜味抑制作用差異不顯著；對于木糖醇，在高添加量時，A4的抑制作用顯著低于HPMP（P＜0.05），但在相同質量濃度下，A4對于山梨糖醇甜度的抑制作用顯著高于HPMP（P＜0.05）?？梢?，HPMP及其衍生物A1～A4在甜味抑制效果的差異無法用簡單的疏水性強弱來解釋。Xia Yi[9]認為HPMP對位的甲氧基增加了芳香環(huán)的疏水性和體積，對甜味抑制活性有積極影響。Nakagita等[25]對一些與HPMP碳骨架相似的非甾體消炎藥物的甜味抑制活性進行分析，發(fā)現(xiàn)甜味受體的結合口袋可以容納不同體積大小的甜味抑制化合物，適當大小的疏水空間可能對保持高甜味抑制活性至關重要。由HPMP和甜味受體的分子對接結果可知[26-27]，HPMP的苯環(huán)與多種氨基酸殘基組成的結合口袋存在疏水相互作用，苯環(huán)對位的甲氧基正好朝向疏水性口袋內部。通過對比各疏水性基團的體積參數(shù)（丙氧基＞乙氧基＞甲氧基＞甲基＞氯原子），提示對位取代基體積大小對甜味抑制效果有一定影響。在甜味抑制識別過程中，芳香環(huán)和對位疏水取代基可能共同構成一個疏水性實體，進入甜味受體的疏水結合空腔，對位基團以甲氧基或與甲氧基體積相近的甲基、氯原子為佳，乙氧基、丙氧基等大體積疏水基團由于空間障礙可能不易于進入疏水口袋，會導致抑制活性的下降。

2.4 HPMP及其衍生物的滋味分析

利用電子舌評估HPMP及其衍生物A1～A4自身除甜味外的其他味覺指標，結果見圖5。HPMP及其衍生物A1～A4在酸味、苦味、澀味方面比較突出，但鮮味和咸味不明顯。在酸味方面，HPMP的酸味最強，接下來依次為A4、A1、A3、A2，說明將苯環(huán)的甲氧基修飾為其他疏水性更強的基團，對于HPMP自身酸味有一定的改善作用，可能與各甜味抑制化合物的質子化有機酸濃度和氫離子濃度有關[28]。據(jù)報道，苦澀味與疏水性存在一定的相關性，疏水性越強，苦澀味越明顯[29]。各甜味抑制化合物在澀味方面比較接近，HPMP的澀味最弱；在苦味方面差異較大，HPMP苦味最弱，乙氧基修飾的A1和甲基修飾的A4具有中等強度的苦味，丙氧基、氯原子等強疏水性基團的修飾使得A2、A3的苦味最強。由于苦味傳感器基于疏水作用和電荷吸附作用檢測苦味物質，相比于其他傳感器，會產生更顯著的響應[30]，各衍生物與HPMP之間實際的苦味差異仍有待進一步探討。

圖5 HPMP及其衍生物A1～A4的電子舌雷達圖Fig. 5 Radar map of electronic tongue responses to HPMP and its derivatives A1-A4

為考察各化合物在使用時是否引入上述不良滋味，進一步測定了含有不同甜味抑制化合物的蔗糖溶液除甜味外的其他味覺指標，結果見圖6。添加有HPMP及其衍生物A1～A4的蔗糖溶液相比于純蔗糖溶液，都具有更明顯的酸味、苦味、澀味和苦味回味。潘露云[31]、武雯[23]研究也顯示HPMP加入蔗糖溶液后，會引入一定的酸味和苦味，容易使蔗糖喪失正常的風味，鈉鹽化或鋅鹽化對這些不良滋味有明顯的改良作用。在前期口嘗含有HPMP的蔗糖溶液時，感評人員感受到的異味以酸澀味為主，對苦味的感知并不明顯，一方面可能是口嘗過程中，苦味被酸味所抑制；另一方面可能是本研究中的苦味傳感器C00主要針對食品中酸性物質的苦味[22]，不排除人們在感評過程將酸澀味和苦味混淆。此外，先前有文獻報道HPMP是潛在的鮮味抑制劑[32]，本研究中HPMP及其衍生物的添加都使蔗糖溶液的鮮味值降低，說明與HPMP一致，衍生物A1～A4也是潛在的鮮味抑制劑。

圖6 含有不同甜味抑制化合物的蔗糖溶液的電子舌雷達圖Fig. 6 Radar map of electronic tongue responses to sucrose solutions containing different sweetness inhibitors

3 結 論

本研究以電子舌甜度抑制率為評價指標，分析了不同質量濃度的HPMP對蔗糖甜度的抑制作用，初步構建了基于電子舌的甜味抑制效果評價方法，并選擇與蔗糖甜度相當?shù)哪咎谴甲鳛樘鹞遁d體進行驗證。結果表明，電子舌可以客觀反映HPMP對蔗糖、木糖醇的甜味抑制規(guī)律，并且電子舌甜度抑制率與口嘗甜度抑制率具有較好的一致性。

基于建立的電子舌甜味抑制效果評價方法，考察HPMP及其衍生物A1～A4對蔗糖、果糖、木糖醇、山梨糖醇甜度的影響。結果表明，以不同的疏水性基團修飾苯環(huán)對位，衍生物A1～A4同樣能夠抑制4 種甜味劑的電子舌甜度，一定程度上說明對位基團疏水性對于甜味抑制的重要性，但初步推測疏水性基團體積大小而非疏水性強弱是影響甜味抑制效果的關鍵因素。當不同的烷氧基修飾苯環(huán)對位，甜味抑制活性隨著疏水基團體積的增大有所下降。氯原子修飾的衍生物A3和甲基修飾的衍生物A4在甜味抑制效果方面與HPMP相近，可改善HPMP自身酸味，但苦味有所增強，添加到甜味劑中也會帶來上述異味刺激。因此，如何合理優(yōu)化衍生物結構，使其在發(fā)揮高強度甜味抑制作用的同時，平衡酸味、苦澀味等異味刺激，是今后甜味抑制研究的一個關鍵性問題。本研究對于新型甜味抑制劑的開發(fā)和甜味抑制機理的完善提供了重要參考。