郭明媚，孔艷輝，李曉賀，杜志磊，范新光，貢漢生,*

（1.魯東大學(xué)食品工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025；2.煙臺(tái)市園林建設(shè)養(yǎng)護(hù)中心，山東 煙臺(tái) 264000）

鏈格孢霉（Alternariasp.）在自然界的土壤、糞便、禾草及空氣等環(huán)境中廣泛存在[1]，大多數(shù)種類(lèi)兼性寄生于植物上，易引起多種經(jīng)濟(jì)植物病害，造成田間和產(chǎn)后損失。鏈格孢毒素是由鏈格孢屬類(lèi)真菌產(chǎn)生的一類(lèi)有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物[2]，鏈格孢毒素可污染糧食、水果、蔬菜等多種農(nóng)產(chǎn)品[3]，嚴(yán)重威脅食品安全、危害人體健康[4]。在我國(guó)，每年由鏈格孢霉引起的水果腐爛都會(huì)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[5]，且其潛在的毒性是威脅農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的風(fēng)險(xiǎn)之一[6]。本實(shí)驗(yàn)室從腐爛櫻桃中分離出霉菌60 株，其中鏈格孢霉14 株，這說(shuō)明鏈格孢霉是引起甜櫻桃腐敗的主要菌種之一[7]。

當(dāng)前可用于水果保鮮的天然抑制霉菌物質(zhì)較少，乳酸菌等微生物產(chǎn)生的苯乳酸有很好的應(yīng)用潛力。苯乳酸全名為2-羥基-3-苯基丙酸，又名β-苯基乳酸和3-苯基乳酸，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型天然有機(jī)酸。苯乳酸具有廣譜的抑菌作用[8-9]，對(duì)于毛霉、鏈格孢霉等真菌及大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、腸球菌以及沙門(mén)氏菌等細(xì)菌均具有抑菌活性[10-11]。苯乳酸可由大多數(shù)乳酸菌通過(guò)苯丙氨酸代謝途徑發(fā)酵產(chǎn)生，安全無(wú)毒[12]，這使得苯乳酸在生物防腐方面受到廣泛關(guān)注[13]。

苯乳酸可以抑制引起甜櫻桃腐爛的鏈格孢霉的生長(zhǎng)，有用于制備櫻桃保鮮劑的潛力。本實(shí)驗(yàn)室利用苯乳酸與海藻酸鈉制備了涂膜保鮮劑保鮮甜櫻桃，涂膜后的甜櫻桃腐爛率明顯降低且可延緩成熟和衰老，保鮮期明顯延長(zhǎng)[14]。

當(dāng)前苯乳酸對(duì)于細(xì)菌的抑制作用機(jī)理研究較多，如寧亞維等[15]發(fā)現(xiàn)苯乳酸通過(guò)破壞細(xì)胞膜的完整性抑制熒光假單胞菌正常的生長(zhǎng)繁殖。苯乳酸對(duì)于真菌的抑制作用機(jī)理研究較少，然而霉菌是引起水果腐敗的主要原因[7]，為促進(jìn)苯乳酸在果蔬保鮮中的應(yīng)用，有必要研究苯乳酸抑制霉菌的作用機(jī)理。苯乳酸抑制霉菌的作用機(jī)理與抑制細(xì)菌的作用機(jī)理有所不同，目前尚未找到苯乳酸抑制霉菌的主要作用靶位，不能消除人們對(duì)其安全性的顧慮，極大影響了苯乳酸在水果貯運(yùn)保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用[16]。通過(guò)卡爾科弗盧爾熒光增白劑染液（calcofluor white stain，CFW）染色觀察鏈格孢霉菌絲頂端形態(tài)、掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察鏈格孢霉菌絲超微結(jié)構(gòu)、測(cè)定苯乳酸作用前后鏈格孢霉上清液中N-乙酰葡萄糖胺質(zhì)量濃度變化、熒光雙染色法等實(shí)驗(yàn)方法來(lái)尋找苯乳酸抑制鏈格孢霉的作用靶位，進(jìn)而明確苯乳酸抑制霉菌作用機(jī)理，從而指導(dǎo)和促進(jìn)苯乳酸在水果保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用，開(kāi)發(fā)基于苯乳酸的水果保鮮劑，延長(zhǎng)易腐水果的保鮮期，提高我國(guó)水果銷(xiāo)售品質(zhì)，擴(kuò)大銷(xiāo)售范圍。同時(shí)，明確苯乳酸抑制鏈格孢霉作用機(jī)理后，可聯(lián)合與其有相似作用機(jī)理的其他方法組成柵欄技術(shù)進(jìn)行易腐水果的防腐保鮮，為苯乳酸在水果保鮮領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

供試菌株：鏈格孢霉（Alternariasp.）LD3.0086，從腐敗櫻桃（‘美早’櫻桃）中分離得到，鑒定后保藏于魯東大學(xué)食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心。

苯乳酸（CAS號(hào)：20312-36-1） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）熒光染料生工生物（上海）股份有限公司；雙乙酸熒光素（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）熒光染料 上海迪柏化學(xué)品技術(shù)有限公司；CFW 北京酷來(lái)搏科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JEM-1230透射電子顯微鏡 日本JEOL公司；MERLIN掃描電子顯微鏡 德國(guó)ZEISS公司；TH4-200倒置熒光顯微鏡 日本Olympus公司；Epoch酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 鏈格孢霉孢子懸浮液、菌絲的制備

采用Lachhab等[17]的方法，將鏈格孢霉接種到察氏培養(yǎng)基平皿上，28 ℃培養(yǎng)10 d，以無(wú)菌生理鹽水洗下孢子，并用6 層紗布過(guò)濾除去菌絲。采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子懸浮液的孢子濃度為1×106個(gè)/mL，現(xiàn)用現(xiàn)制。

吸取孢子懸浮液1 mL加入到100 mL察氏液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)24 h，獲得鏈格孢霉新鮮菌絲，備用。

1.3.2 苯乳酸對(duì)鏈格孢霉抑制能力的測(cè)定

分別稱(chēng)取一定量的苯乳酸，溶于察氏液體培養(yǎng)基中，使其濃度分別為12.5、25.0、37.5、50.0、62.5、75.0、87.5、100.0 mmol/L。向96 孔板孔內(nèi)加入200 μL濃度為1×106個(gè)/mL的孢子液，并分別加入50 μL上述苯乳酸溶液使其終濃度分別達(dá)到2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 mmol/L。以不加苯乳酸及菌液的空白培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，以不加苯乳酸的菌液作為生長(zhǎng)對(duì)照。置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于48 h時(shí)用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD600nm，以表征苯乳酸對(duì)鏈格孢霉的抑制能力。

1.3.3 鏈格孢霉菌絲頂端生長(zhǎng)細(xì)胞形態(tài)的觀察

選取經(jīng)12.5 mmol/L的苯乳酸（處理組）或無(wú)菌水（對(duì)照組）處理8 h的菌絲，將備檢菌絲置于干凈載玻片，滴一滴CFW染色劑和一滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%氫氧化鉀溶液，將蓋玻片置于樣本上，靜置染色1 min，置于倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照[18]。

1.3.4 鏈格孢霉菌絲形態(tài)的觀察

取適量濕菌絲，用12.5 mmol/L苯乳酸溶液（處理組）或無(wú)菌水（對(duì)照組）處理24 h后用無(wú)菌水清洗菌絲3 次，除去苯乳酸，按照掃描電子顯微鏡樣品制備方法制備樣品[19]。用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗菌絲3 次，置于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中4 ℃下過(guò)夜固定。將固定好的菌絲用磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，每次靜置10 min，除去戊二醛；將樣品依次置于系列體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液中脫水置換，每次15 min。脫水后臨界點(diǎn)干燥，將干燥的菌體固定到金屬臺(tái)上，用離子濺射儀對(duì)金屬臺(tái)噴金、鍍膜，進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.5 鏈格孢霉菌絲的超微結(jié)構(gòu)觀察

將1.3.4節(jié)中乙醇脫水后的樣品，繼續(xù)用丙酮脫水3 次，用Epon 812固定劑進(jìn)行包埋，超薄切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后，采用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察和圖像采集[20]。

1.3.6 鏈格孢霉菌絲細(xì)胞壁完整性的分析

取適量濕菌絲用12.5 mmol/L苯乳酸溶液（處理組）或無(wú)菌水（對(duì)照組）處理24 h，每隔2 h取樣，1 0 000 r/min離心5 min后取1 mL上清液，置于試管內(nèi)，在試管內(nèi)，加入0.1 mL 0.5 mol/L碳酸鈉溶液，沸水浴中加熱5 min，冷卻后添加冰醋酸溶液至2 mL，加入對(duì)二甲氨基苯甲醛試劑1 mL，用乙酸補(bǔ)足10 mL。充分混勻，靜置后使用分光光度計(jì)于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。利用取N-乙酰葡糖胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)? mL標(biāo)準(zhǔn)溶液代替上清液作相同處理，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算溶液中N-乙酰葡糖胺的質(zhì)量濃度[21]。

1.3.7 鏈格孢霉菌絲細(xì)胞膜完整性的分析

取適量濕菌絲用12.5 mmol/L的苯乳酸溶液（處理組）或無(wú)菌水（對(duì)照組）分別處理0、4 h和8 h，取處理好的菌絲重懸于無(wú)菌水中得到菌絲懸浮液，在1 mL菌絲懸浮液中加入1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL FDA熒光探針，37 ℃避光孵育20 min后，再加入1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL熒光探針PI，室溫避光反應(yīng)10 min。用無(wú)菌水漂洗多余探針后置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照[22]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值，采用Origin 2018軟件分析數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯乳酸對(duì)鏈格孢霉的最小抑菌濃度

苯乳酸作用48 h時(shí)測(cè)定96 孔板的OD600nm，結(jié)果如圖1A所示，OD600nm隨苯乳酸濃度的增加先升高后逐漸下降。因此，苯乳酸對(duì)鏈格孢霉的作用效果為較低濃度促進(jìn)生長(zhǎng)，高濃度抑制生長(zhǎng)。苯乳酸隨濃度升高抑制作用逐漸增強(qiáng)，且抑制作用呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)。如圖1B所示，空白對(duì)照組培養(yǎng)基清澈；可明顯看出生長(zhǎng)對(duì)照組菌絲生長(zhǎng)旺盛，在苯乳酸濃度為2.5、5.0 mmol/L時(shí)，苯乳酸對(duì)鏈格孢霉存在一定的生長(zhǎng)促進(jìn)作用，苯乳酸濃度超過(guò)7.5 mmol/L后抑制其生長(zhǎng)，當(dāng)苯乳酸濃度達(dá)到12.5 mmol/L時(shí)，所在微孔的液體澄清，無(wú)菌絲生長(zhǎng)，且更高濃度的微孔內(nèi)均無(wú)菌絲生長(zhǎng)，初步認(rèn)定苯乳酸對(duì)鏈格孢霉的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentratio，MIC）為12.5 mmol/L，后面的實(shí)驗(yàn)均在該濃度下進(jìn)行。

圖1 苯乳酸對(duì)鏈格孢霉的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of phenyllactic acid on Alternaria sp.

2.2 苯乳酸作用前后鏈格孢霉菌絲頂端生長(zhǎng)細(xì)胞的形態(tài)變化

CFW是一種熒光染料，它與真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，在一定的長(zhǎng)波紫外光照射下，經(jīng)CFW染色的真菌會(huì)發(fā)出亮藍(lán)色熒光。由圖2可清晰看出，未經(jīng)苯乳酸處理的對(duì)照組菌絲頂端較為平整，顏色均勻統(tǒng)一，經(jīng)苯乳酸處理8 h后的菌絲頂端依然平整光滑，未見(jiàn)明顯形變，這說(shuō)明苯乳酸對(duì)鏈格孢霉菌絲頂端生長(zhǎng)細(xì)胞基本沒(méi)有明顯破壞作用。

圖2 鏈格孢霉菌絲頂端生長(zhǎng)細(xì)胞的形態(tài)Fig. 2 Effect of phenyllactic acid on morphology of hyphal tip-growing cells of Alternaria alternata

2.3 苯乳酸對(duì)鏈格孢霉菌絲形態(tài)的影響

通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察苯乳酸對(duì)鏈格孢霉菌絲形態(tài)的影響（圖3），對(duì)照組菌絲表面形態(tài)光滑飽滿（圖3A1～A3），與對(duì)照組相比，12.5 mmol/L的苯乳酸處理24 h后的鏈格孢霉菌絲表面形態(tài)出現(xiàn)了部分凹陷及褶皺（圖3B1、B2）；菌絲周邊有少量?jī)?nèi)容物泄漏（圖3B3），菌絲有聚集的傾向。但總體來(lái)看，菌絲并未發(fā)生明顯的形態(tài)變化。

圖3 鏈格孢霉菌絲掃描電子顯微鏡圖Fig. 3 Scanning electron microscopic image of Alternaria sp. hyphae

2.4 苯乳酸對(duì)鏈格孢霉超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電子顯微鏡下觀察苯乳酸對(duì)鏈格孢霉超微結(jié)果的變化影響，結(jié)果如圖4所示。未經(jīng)苯乳酸處理的鏈格孢霉細(xì)胞規(guī)則，細(xì)胞壁完整，細(xì)胞膜完整光滑，細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密，細(xì)胞膜緊貼細(xì)胞壁，細(xì)胞質(zhì)均勻，液泡等細(xì)胞器清晰可見(jiàn)（圖4A1～A3）；而經(jīng)12.5 mmol/L苯乳酸處理24 h后，菌絲細(xì)胞壁未發(fā)現(xiàn)明顯破損（圖4B1），細(xì)胞膜邊緣不再清晰，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞內(nèi)隔膜消失，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)無(wú)序化并固縮成顆粒狀、碎片狀（圖4B1～B3）。由此可見(jiàn)，苯乳酸處理24 h后，細(xì)胞壁未發(fā)生明顯破損，細(xì)胞膜稍有損傷，細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞器的變化較大，這說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)部的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器可能是苯乳酸的主要作用靶位。

圖4 鏈格孢霉菌絲透射電子顯微鏡圖Fig. 4 Transmission electron microscopic image of Alternaria sp. hyphae

2.5 苯乳酸對(duì)鏈格孢霉細(xì)胞壁的影響

霉菌細(xì)胞壁的主要成分為幾丁質(zhì)，是由N-乙酰葡萄糖胺通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接而成的鏈狀結(jié)構(gòu)。若苯乳酸破壞霉菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)或抑制幾丁質(zhì)的合成，將會(huì)有大量N-乙酰葡萄糖胺釋放到胞外。如圖5所示，隨苯乳酸處理時(shí)間延長(zhǎng)，鏈格孢霉上清液中N-乙酰葡萄糖胺的質(zhì)量濃度先升高再降低后升高，隨后趨于平穩(wěn)，與未經(jīng)苯乳酸處理的鏈格孢霉上清液（對(duì)照）相比，處理組N-乙酰葡萄糖胺的質(zhì)量濃度變化趨勢(shì)基本相同，兩組N-乙酰葡萄糖胺的質(zhì)量濃度無(wú)明顯差異?？梢哉f(shuō)明苯乳酸對(duì)霉菌細(xì)胞壁沒(méi)有明顯的破壞作用，霉菌細(xì)胞壁不是苯乳酸的主要作用靶位。

圖5 苯乳酸作用前后鏈格孢霉上清液中N-乙酰葡萄糖胺質(zhì)量濃度的變化Fig. 5 Concentrations of N-acetylglucosamine in the culture supernatant of Alternaria sp. before and after treatment with phenyllactic acid

2.6 苯乳酸對(duì)鏈格孢霉細(xì)胞膜的影響

FDA可進(jìn)入細(xì)胞，在活細(xì)胞內(nèi)被酯酶水解產(chǎn)生熒光物質(zhì)，并能在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，應(yīng)用FDA染色可以檢測(cè)細(xì)胞的活性。PI是核酸染料，不能透過(guò)完整細(xì)胞膜，只能進(jìn)入膜破損的細(xì)胞而使細(xì)胞核染色，并在熒光顯微鏡下發(fā)出紅色熒光。應(yīng)用FDA/PI熒光雙染色法可以檢測(cè)菌絲細(xì)胞的活性和細(xì)胞膜的完整性[23-24]。由圖6可知，未經(jīng)苯乳酸作用的鏈格孢霉，在藍(lán)紫光激發(fā)下可見(jiàn)明亮綠色，在綠光激發(fā)下未見(jiàn)到明顯的亮紅色，這說(shuō)明未經(jīng)苯乳酸作用的鏈格孢霉菌絲為活體，細(xì)胞膜完整。苯乳酸處理組剛開(kāi)始時(shí)（0 h）菌絲在藍(lán)紫光激發(fā)下呈現(xiàn)明顯的綠色，在綠光激發(fā)下未見(jiàn)明顯紅色。苯乳酸作用4 h后，菌絲大部分部位仍然呈現(xiàn)明顯的綠色，稍有紅色，與水處理組相比差異不大，這說(shuō)明苯乳酸短時(shí)間作用后的鏈格孢霉菌絲細(xì)胞膜仍完整；隨著作用時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)（8 h），經(jīng)苯乳酸作用后的菌絲亮綠色基本消失，菌絲基本都呈現(xiàn)紅色，這說(shuō)明鏈格孢霉的細(xì)胞膜已發(fā)生破損，PI已進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部使細(xì)胞核染色。

圖6 苯乳酸對(duì)鏈格孢霉細(xì)胞膜的影響Fig. 6 Effect of phenyllactic acid on the cell membrane of Alternaria sp.

3 討 論

本研究結(jié)果顯示苯乳酸對(duì)鏈格孢霉的MIC為12.5 mmol/L（2 mg/mL），與Prema等[25]研究中提到苯乳酸對(duì)真菌的MIC對(duì)比，對(duì)鏈格孢霉的MIC更小。通過(guò)CFW染色、掃描電子顯微鏡觀察、透射電子顯微鏡觀察、菌絲上清液中N-乙酰葡萄糖胺的質(zhì)量濃度測(cè)定及FDA/PI熒光雙染色法等對(duì)苯乳酸抑制鏈格孢霉LD3.0086的作用靶位進(jìn)行了初步探索。

苯乳酸對(duì)于鏈格孢霉的菌絲細(xì)胞頂端生長(zhǎng)并未造成明顯影響。此前Virágh等[26]研究發(fā)現(xiàn)新薩氏菌抗真菌蛋白（Neosartorya fischeriantifungal protein，NFAP）作用于構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）后，通過(guò)CFW染色觀察到菌絲頂端發(fā)生了明顯的形變，說(shuō)明NFAP對(duì)構(gòu)巢曲霉菌絲頂端生長(zhǎng)造成了影響。然與其對(duì)比可發(fā)現(xiàn)，苯乳酸作用前后，CFW染色結(jié)果顯示菌絲頂端細(xì)胞外邊緣仍較為順滑，并無(wú)明顯缺失或凸起，即苯乳酸不是通過(guò)影響鏈格孢霉菌絲頂端生長(zhǎng)來(lái)抑制鏈格孢霉。

苯乳酸在抑制鏈格孢霉時(shí)未破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。本研究通過(guò)掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)苯乳酸處理后鏈格孢霉菌絲細(xì)胞壁沒(méi)有明顯破損和缺失，之后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)苯乳酸作用前后霉菌上清液中N-乙酰葡萄糖胺質(zhì)量濃度沒(méi)有發(fā)生明顯變化，以上結(jié)果說(shuō)明苯乳酸對(duì)于真菌鏈格孢霉的主要作用靶位不是細(xì)胞壁。此前一些研究顯示苯乳酸對(duì)細(xì)菌的抑制中細(xì)胞壁是主要作用靶位，如袁景環(huán)等[27]發(fā)現(xiàn)苯乳酸作用于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的主要作用靶位是細(xì)胞壁；Dieulevenx等[28]認(rèn)為苯乳酸對(duì)腸膜明串珠菌（Leuconostoc monocytogenes）的作用位點(diǎn)之一是細(xì)胞壁。王鳳婷[29]發(fā)現(xiàn)苯乳酸對(duì)陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）的作用方式主要是破壞細(xì)胞壁的形態(tài)，改變細(xì)胞膜通透性，進(jìn)而改變細(xì)胞內(nèi)外電勢(shì)，最后內(nèi)容物流出導(dǎo)致細(xì)胞死亡。與細(xì)菌相比，細(xì)胞壁不是苯乳酸抑制真菌的主要作用靶位。

苯乳酸對(duì)于鏈格孢霉的細(xì)胞膜并沒(méi)有直接造成明顯損傷。FDA/PI染色結(jié)果顯示苯乳酸作用4 h時(shí)細(xì)胞膜仍較為完整，作用8 h后細(xì)胞膜明顯破損，菌絲全部染成紅色，菌體死亡。Ning Yawei等[30]在研究苯乳酸和乳酸對(duì)蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）協(xié)同抗菌機(jī)理時(shí)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)苯乳酸處理2 h后的細(xì)菌細(xì)胞膜完整性已受到嚴(yán)重破壞。黃云坡等[31]通過(guò)熒光探針標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)苯乳酸對(duì)L. monocytogenes10403s的細(xì)胞膜通透性和完整性在1 h時(shí)已有嚴(yán)重破壞，這說(shuō)明若是直接破壞細(xì)胞膜，在較短時(shí)間內(nèi)即會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞膜破損現(xiàn)象，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，苯乳酸作用于鏈格孢霉短時(shí)間內(nèi)（4 h）細(xì)胞膜并未造成明顯破壞，而在8 h時(shí)損傷嚴(yán)重，這說(shuō)明苯乳酸并非通過(guò)直接破壞鏈格孢霉細(xì)胞膜的完整性抑制霉菌，推測(cè)其破壞了霉菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，霉菌產(chǎn)生自溶酶等進(jìn)一步破壞了霉菌的細(xì)胞膜。

通過(guò)透射電子顯微鏡可清晰觀察到鏈格孢霉細(xì)胞內(nèi)部較為明顯的變化，例如苯乳酸作用后細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)的無(wú)序化，固縮成顆粒狀等現(xiàn)象均說(shuō)明苯乳酸進(jìn)入鏈格孢霉菌絲內(nèi)部，破壞了其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CFW染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苯乳酸未抑制菌絲頂端細(xì)胞生長(zhǎng)；通過(guò)檢測(cè)苯乳酸作用前后鏈格孢霉上清液中N-乙酰葡萄糖胺的質(zhì)量濃度變化、掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察得出苯乳酸抑制鏈格孢霉的主要作用靶位不是細(xì)胞壁；通過(guò)FDA/PI染色實(shí)驗(yàn)得出苯乳酸并非通過(guò)直接破壞鏈格孢霉的細(xì)胞膜發(fā)揮抑制作用。推測(cè)苯乳酸進(jìn)入細(xì)胞后破壞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)或引起細(xì)胞內(nèi)一系列的生化反應(yīng)，從而發(fā)揮抑菌作用。