鄂志野，文怡欣，張 珊，聶 影，趙珈華，海艷潔，鞠寶玲，張紅軍

(牡丹江醫(yī)學(xué)院 1.免疫學(xué)教研室；2.病原生物學(xué)教研室；3.附屬紅旗醫(yī)院腫瘤科,黑龍江 牡丹江 157011)

肝細(xì)胞癌是全球發(fā)病率及死亡率均較高危害最為嚴(yán)重的腫瘤之一[1]，其死亡率在癌癥相關(guān)的死亡率中排名第三，每年在全球范圍內(nèi)因肝癌造成的死亡人數(shù)超過50萬[2]。HCC占所有原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer，PLC)病例的75%～85%，是PLC的主要組織學(xué)類型。在臨床中，甲胎蛋白(AFP)作為一種診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物發(fā)揮著重要作用，但其敏感性和特異性不令人滿意，一些生理活動(dòng)可能影響AFP的表達(dá)，因此，篩選對(duì)肝癌更敏感的診斷及預(yù)后生物標(biāo)志物對(duì)于指導(dǎo)肝癌的治療具有重要意義。

Ⅰ型膠原蛋白存在于大多數(shù)結(jié)締組織和胚胎組織中，是膠原蛋白家族的重要成員，而膠原蛋白家族是細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分。Ⅰ型膠原蛋白由兩條Ⅰ型膠原蛋白α1(COL1A1)鏈和一條Ⅰ型膠原蛋白α2(COL1A2)鏈組成。COL1A2具有多種生物學(xué)功能，近年來發(fā)現(xiàn)可在結(jié)腸癌、黑色素瘤等多種組織呈高表達(dá)狀態(tài)，且在癌細(xì)胞增殖、分化、侵襲等病理過程中發(fā)揮作用[3]，本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)探討COL1A2在HCC組織的表達(dá)變化及其對(duì)肝癌預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 癌癥的基因分析通過GEPIA 2.0(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)利用TCGA數(shù)據(jù)在線分析COL1A2在正常肝組織中及HCC組織中的表達(dá)量。通過UALCAN(http://ulcan.path.uab.edu/index.html)在線分析COL1A2與HCC腫瘤分級(jí)，分期及TP53基因突變的相關(guān)性，探討COL1A2對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展的影響。

1.2 生存分析利用Kaplan-Meier(http://kmplot.com/analysis)網(wǎng)站評(píng)估COL1A2的差異表達(dá)對(duì)HCC整體存活率(OS)、無進(jìn)展生存率(PFS)，無復(fù)發(fā)存活率(RFS)的影響。

1.3 免疫浸潤(rùn)分析利用TIMER(http://timer.comp-genomics.org/)在線分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)HCC腫瘤組織中COL1A2的表達(dá)水平與CD8+T淋巴細(xì)胞腫瘤組織浸潤(rùn)的相關(guān)性。通過GEPIA 2.0網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)在線分析HCC癌組織中COL1A2的表達(dá)與T淋巴細(xì)胞免疫抑制檢查點(diǎn)PD-1、CTLA4的相關(guān)性。

1.4 GEO分析在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE101728(HCC中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達(dá)譜)GSE134568(間充質(zhì)亞型HCC基因表達(dá)數(shù)據(jù))GSE135375(miR-221介導(dǎo)HCC基因表達(dá)數(shù)據(jù))數(shù)據(jù)集，綜合分析驗(yàn)證COL1A2在肝臟組織與HCC癌組織中的差異表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 COL1A2與HCC發(fā)展的相關(guān)性COL1A2表達(dá)在肝腫瘤組織中上調(diào)，并且COL1A2在存活時(shí)間的臨床意義也得到證實(shí)(如圖2)。為了進(jìn)一步了解COL1A2對(duì)HCC發(fā)展的影響，我們?cè)赨ALCAN分析了COL1A2的表達(dá)與肝癌腫瘤分級(jí)，腫瘤分期和TP53基因突變的相關(guān)性[4]。如(圖1A)所示，隨著腫瘤等級(jí)的增加，COL1A2表達(dá)進(jìn)一步升高。同樣地，隨著腫瘤分期的進(jìn)展，COL1A2表達(dá)也明顯上升(圖1B)，表明COL1A2表達(dá)水平與HCC的進(jìn)展正相關(guān)。此外，TP53基因是機(jī)體的重要抑癌基因。其突變與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，TP53突變是HCC中最常見的突變，它會(huì)影響HCC的進(jìn)展和預(yù)后。我們發(fā)現(xiàn)在TP53突變的HCC組織中COL1A2的表達(dá)較TP53無突變的HCC組織明顯升高(圖1C)，表明TP53基因突變伴隨著COL1A2的高表達(dá)，進(jìn)而提示COL1A2的高表達(dá)與肝癌發(fā)展有關(guān)。

圖1 COL1A2表達(dá)與腫瘤分級(jí)、腫瘤分期和TP53突變的關(guān)系

2.2 COL1A2在HCC癌組織中表達(dá)及其對(duì)患者生存率的影響共納入369例肝癌(HCC)腫瘤樣本和160例正常肝組織樣本，在GEPIA[5]中評(píng)估COL1A2在HCC癌組織中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常肝組織相比，肝腫瘤組織中COL1A2表達(dá)升高(圖2A)。為了進(jìn)一步明確HCC癌組織中COL1A2高表達(dá)對(duì)HCC發(fā)展的影響，我們進(jìn)行了Kaplan-Meier生存分析[6]。如(圖2B～D)所示，COL1A2的表達(dá)量影響了患者無進(jìn)展生存率(PFS)和無復(fù)發(fā)存活率(RFS)，而COL1A2表達(dá)高低對(duì)總體生存率影響差異不顯著，這些結(jié)果表明，肝癌組織中COL1A2水平與肝癌患者的生存預(yù)后有關(guān)，COL1A2表達(dá)高預(yù)后生存率較高，COL1A2表達(dá)低預(yù)后生存率相對(duì)較低。

圖2 COL1A2在正常組織與腫瘤組織中表達(dá)量的對(duì)比及其表達(dá)量的高低對(duì)患者生存預(yù)后的影響

2.3 COL1A2的表達(dá)對(duì)肝癌組織CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)及抗腫瘤活性的影響運(yùn)用Timer探討COL1A2對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫的影響[7]。顯示COL1A2與CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)度顯著相關(guān)(R=0.339，P=9.39×10-11，圖3A)。為進(jìn)一步分析T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤作用，我們?cè)u(píng)估了兩個(gè)經(jīng)典的免疫抑制檢查點(diǎn)，CTLA-4和PD-1與COL1A2表達(dá)的相關(guān)性。如圖3B和3C所示，COL1A2表達(dá)與CTLA-4和PD-1呈正相關(guān)相關(guān)，表明肝腫瘤組織中COL1A2升高會(huì)伴隨腫瘤組織中CTLA-4和PD-1的高表達(dá)。因?yàn)镃TLA-4和PD-1的高表達(dá)可以抑制CD8+T細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞活性，可見COL1A2可以通過調(diào)控CTLA-4和PD-1的表達(dá)繼而抑制CD8+T細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞活性。

圖3 COL1A2的表達(dá)與肝癌組織CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)及CTLA-4、PD-1表達(dá)的相關(guān)性

2.4 通過GEO數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析驗(yàn)證COL1A2在HCC癌組織中的差異表達(dá)基因差異分析從GSE101728[8](HCC中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達(dá)譜)GSE134568(間充質(zhì)亞型HCC基因表達(dá)數(shù)據(jù))GSE135375(miR-221介導(dǎo)HCC基因表達(dá)數(shù)據(jù))三組數(shù)據(jù)分別用GEO2R進(jìn)行差異分析，結(jié)果保留P≤0.05，Log.FC≥1或≤-1，將三組數(shù)據(jù)整理如(圖4)發(fā)現(xiàn)三組數(shù)據(jù)交集基因中包含COL1A2。從而證明COL1A2對(duì)HCC發(fā)展的關(guān)鍵的作用。

圖4 GSE101728、GSE134568和GSE135375三組數(shù)據(jù)差異基因的交集

3 討論

COL1A2是編碼Ⅰ型膠原α2鏈的重要基因，Ⅰ型膠原蛋白由兩條Ⅰ型膠原蛋白α1(COL1A1)鏈和一條Ⅰ型膠原蛋白α2(COL1A2)鏈組成。廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)中。COL1A2 具有多種生物學(xué)功能，異常表達(dá)的甲基化的COL1A2可以引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改變，從而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、動(dòng)靜脈畸形、腦出血等[9]。I型膠原纖維是膠原家族的主要成分，被認(rèn)為是參與腫瘤侵襲和發(fā)展。然而，COL1A2在惡性腫瘤中的表達(dá)水平仍存在爭(zhēng)議。一方面，在腎細(xì)胞癌和HCC檢測(cè)COL1A1頻繁啟動(dòng)子甲基化[10]，COL1A2在黑素瘤[11]，和膀胱癌下調(diào)[12]。在另一方面，COL1A2蛋白和mRNA表達(dá)的結(jié)腸直腸癌[13]和髓母細(xì)胞瘤被上調(diào)。

本研究主要通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)運(yùn)用在線工具GEPIA分析COL1A2在HCC組織表達(dá)量高于正常組織。生存分析顯示，COL1A2低表達(dá)的患者無進(jìn)展生存(PFS)和無復(fù)發(fā)存活(RFS)生存期要長(zhǎng)于高表達(dá)的患者，表明肝癌組織中COL1A2水平與肝癌患者的生存預(yù)后有關(guān)，COL1A2表達(dá)高預(yù)后生存率較低，COL1A2表達(dá)低預(yù)后生存率相對(duì)較高。有研究發(fā)現(xiàn)COL1A2在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及侵襲具有促進(jìn)作用，同時(shí)提高了腫瘤組織的臨床分期[15]。我們也在研究中發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤等級(jí)的增加，COL1A2表達(dá)進(jìn)一步升高。同樣地，隨著腫瘤分期的進(jìn)展，COL1A2表達(dá)也明顯上升，表明COL1A2表達(dá)水平與HCC的進(jìn)展正相關(guān)。此外，TP53基因是機(jī)體的重要抑癌基因。其突變與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，TP53突變是HCC中最常見的突變，它會(huì)影響HCC的進(jìn)展和預(yù)后。我們發(fā)現(xiàn)在TP53突變的HCC組織中COL1A2的表達(dá)較TP53無突變的HCC組織明顯升高，表明TP53基因突變伴隨著COL1A2的高表達(dá)，進(jìn)而提示COL1A2的高表達(dá)與肝癌發(fā)展有關(guān)。

抗腫瘤免疫是決定腫瘤發(fā)展的重要因素，研究探討了COL1A2對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫的影響，顯示COL1A2與CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)度呈正相關(guān)；COL1A2表達(dá)與CTLA-4和PD-1正相關(guān)，表明肝腫瘤組織中COL1A2升高會(huì)伴隨腫瘤組織中CTLA-4和PD-1的高表達(dá)。CTLA-4和PD-1是兩個(gè)經(jīng)典的免疫抑制檢查點(diǎn)，CTLA-4和PD-1的高表達(dá)可以抑制CD8+T細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞活性，可見COL1A2可以通過調(diào)控CTLA-4和PD-1的表達(dá)繼而抑制CD8+T細(xì)胞的殺傷腫瘤細(xì)胞活性。

為進(jìn)一步綜合分析驗(yàn)證COL1A2與肝癌的發(fā)展密切相關(guān)。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)抽取GSE101728(HCC中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達(dá)譜)；GSE134568(間充質(zhì)亞型HCC基因表達(dá)數(shù)據(jù))；GSE135375(miR-221介導(dǎo)HCC基因表達(dá)數(shù)據(jù))三組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析取交集，發(fā)現(xiàn)三組交集的9個(gè)基因里包含COL1A2。顯示COL1A2高表達(dá)與肝癌的發(fā)展密切相關(guān)具有普遍性。

肝癌是世界上最具侵略性的癌癥之一，篩選對(duì)肝癌更敏感的診斷及預(yù)后生物標(biāo)志物對(duì)于指導(dǎo)肝癌的治療具有重要意義。本研究分現(xiàn)，COL1A2可在HCC癌組織中高表達(dá)，通過促進(jìn)TP53基因突變，誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞的免疫抑制與腫瘤的發(fā)展及患者生存密切相關(guān)，由此提示COL1A2具有作為篩查肝癌和判斷治療預(yù)后的標(biāo)志物的潛力。