蘇文文，許曉義，高 山，林怡彤，宋高臣

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.深圳大學(xué)附屬華南醫(yī)院，廣東 深圳 518111)

肝細(xì)胞癌(hepatocellar carcinoma,HCC)是肝臟最常見的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例約85萬(wàn)例[1]。腫瘤的發(fā)生是細(xì)胞周期失常導(dǎo)致的細(xì)胞失控性生長(zhǎng)的結(jié)果。細(xì)胞周期依賴性激酶2(Cyclin dependent kinase2,CDK2)在細(xì)胞周期調(diào)控中具有核心作用。有研究表明[2]，肝癌細(xì)胞中CDK2被特異地沉寂時(shí)，Rb、CyclinE、E2F1基因的mRNA表達(dá)對(duì)CDK2基因的表達(dá)有明顯的依賴性。微小RNA(micoRNA,miRNA)是一類由18～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼單鏈RNA，主要通過(guò)抑制其靶基因的表達(dá)而起負(fù)性調(diào)控作用。miRNA對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)機(jī)制是通過(guò)形成胞漿內(nèi)RNA沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)而對(duì)其靶基因的表達(dá)產(chǎn)生基因沉默或者抑制作用[3]。而miRNA沉默功能的缺失可能導(dǎo)致腫瘤相關(guān)靶基因表達(dá)異常，是引起腫瘤發(fā)生、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移以及抑制腫瘤凋亡的重要因素之一。

為討論肝細(xì)胞癌發(fā)生過(guò)程中miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制，我們建立肝細(xì)胞癌發(fā)生的miRNA差異表達(dá)譜以及篩選肝細(xì)胞癌中調(diào)控CDK2基因表達(dá)的靶miRNA，同時(shí)利用qRT-PCR驗(yàn)證miRNA基因芯片分析結(jié)果，對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行GO富集分析與轉(zhuǎn)錄因子分析，初步探討肝細(xì)胞癌中調(diào)控CDK2基因表達(dá)的靶miRNA，對(duì)后續(xù)相關(guān)機(jī)制的研究以及抗肝癌藥物開發(fā)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料從牡丹江市腫瘤醫(yī)院腹瘤科收集3例肝細(xì)胞癌組織(tumor section,TS)及癌旁組織(normal section,NS)標(biāo)本，均經(jīng)術(shù)后病理確定。RNA提取試劑盒mirVanaTM RNA Isolation Kit、miScriptII Reverse Transcription Kit試劑盒與miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒均購(gòu)買于Qiagen公司；Nanodrop分光光度計(jì)、Agilent 2100生物分析儀、Agilent Microarray Scanner掃描儀(美國(guó)Agilent公司)。

1.2 方法

1.2.1 miRNA芯片差異篩選 利用RNA提取試劑盒mirVanaTM RNA Isolation Kit(AM1561)提取組織Total RNA，利用Agilent 2100生物分析儀鑒定樣品總RNA的完整性，RNA完整性評(píng)分均大于7.0分的標(biāo)本可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由上海歐意公司基于Agilent芯片分析試劑盒進(jìn)行miRNA基因芯片分析，采用Agilent Microarray Scanner掃描儀掃描芯片結(jié)果。利用miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)(Targetscan、MiRanda、PicTar)反向預(yù)測(cè)CDK2相關(guān)的miRNA。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證芯片差異表達(dá)的miRNA 根據(jù)miScriptII Reverse Transcription Kit試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，冰上配制Reverse-transcription master mix。在PCR儀中37 ℃孵育60 min，然后95 ℃下孵育5 min，以滅活管中miScript Reverse Transcriptase Mix。將所得cDNA按一定倍數(shù)稀釋后加入Real Time PCR反應(yīng)體系中定量檢測(cè)。下游引物使用Qiagen通用反向引物的miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒中提供的通用引物，上游引物由艾博思公司設(shè)計(jì)與合成，以人U6 snRNA為內(nèi)參。配制反應(yīng)體系，通過(guò)ABI stepone定量?jī)x器檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果。采用擴(kuò)增曲線和溶解曲線來(lái)分析檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物的特異性。結(jié)果以CT值顯示，即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到閾值所經(jīng)歷的PCR循環(huán)數(shù)，閾值取機(jī)器自動(dòng)默認(rèn)值。采用相對(duì)定量法分析肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織中miRNA(所逆轉(zhuǎn)錄的cDNA)：設(shè)置對(duì)照組，U6為內(nèi)參基因，結(jié)果(CT值)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，△CT指同一樣品中，待檢基因與內(nèi)參基因平均CT值的差值?！鳌鰿T=(樣本組△CT)-(對(duì)照組△CT)，以2-△△CT表示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中miRNA的倍比關(guān)系，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(n=3)。

1.2.3 miRNA芯片結(jié)果與qRT-PCR驗(yàn)證CDK2基因靶miRNA結(jié)果對(duì)比分析 將臨床樣本芯片分析miRNA差異表達(dá)譜與qRT-PCR驗(yàn)證的CDK2調(diào)控靶miRNA進(jìn)行對(duì)比分析，篩選出表達(dá)水平相同的miRNA。

1.2.4 基因本體論(Gene Ontology,GO)富集分析與轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factor,TF)分析 利用Richfun軟件(http://funrich.org/download)對(duì)調(diào)控CDK2基因的靶miRNA進(jìn)行GO富集分析和TF分析。通過(guò)GO分析中的細(xì)胞組成(Cellular Component,CC)、生物過(guò)程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)三個(gè)過(guò)程對(duì)miRNA的功能進(jìn)行多方面的描述。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用相對(duì)定量法分別分析樣本差異表達(dá)的miRNA(所逆轉(zhuǎn)錄的cDNA)與U6內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果(CT值)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，計(jì)算出2-△△CT值。所得數(shù)據(jù)對(duì)U6內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)配對(duì)t檢驗(yàn)分析，P<0.05表示有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 miRNA芯片差異篩選結(jié)果前期研究[4-5]發(fā)現(xiàn)肝癌及癌旁組織的miRNA基因芯片表達(dá)譜分析共檢測(cè)到2549個(gè)miRNA，其中有174個(gè)差異表達(dá)的miRNA(FC≥2或<0.5)，上調(diào)有97個(gè)，下調(diào)有77個(gè)。利用miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)(Targetscan、MiRanda、PicTar)反向預(yù)測(cè)CDK2相關(guān)的靶miRNA有54個(gè)。將miRNA差異表達(dá)譜結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)所查閱的CDK2相關(guān)靶miRNA進(jìn)行比對(duì)，篩選出9個(gè)miRNA與芯片結(jié)果相一致，見圖1。如表1所示，包括6個(gè)表達(dá)上調(diào)的miRNA：hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-1237-3p，hsa-miR-410-3p，hsa-miR-381-3p，hsa-miR-539-5p；和3個(gè)表達(dá)下調(diào)的miRNA：hsa-miR-214-3p，hsa-miR-375，hsa-miR-200a-3p。

圖1 芯片miRNA表達(dá)譜與數(shù)據(jù)庫(kù)CDK2相關(guān)miRNA差異表達(dá)的共同miRNA

2.2 與CDK2相關(guān)的miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，與癌旁組織相比，hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-214-3p在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而hsa-miR-1237-3p、hsa-miR-410-3p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-200a-3p在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，見表2。

表2 qRT-PCR驗(yàn)證miRNA在肝細(xì)胞癌及癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.3 臨床樣本芯片分析miRNA差異表達(dá)譜與qRT-PCR驗(yàn)證的CDK2調(diào)控靶miRNA的對(duì)比分析將qRT-PCR的驗(yàn)證結(jié)果分別與miRNA芯片結(jié)果數(shù)據(jù)比對(duì)，所驗(yàn)證的9個(gè)miRNA中，發(fā)現(xiàn)4個(gè)miRNA 與芯片結(jié)果上下調(diào)一致，分別是hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-222-3p表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)，hsa-miR-375、hsa-miR-200a-3p表現(xiàn)為表達(dá)下調(diào)，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。其他5種miRNA比對(duì)結(jié)果是芯片結(jié)果與qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果不相符，無(wú)后續(xù)研究?jī)r(jià)值。

表3 miRNA芯片結(jié)果與qRT-PCR驗(yàn)證CDK2基因靶miRNA結(jié)果對(duì)比分析

2.4 miR-200a-3p、miR-375、miR-200a-3p和miR-375的GO富集分析與轉(zhuǎn)錄因子分析如圖2所示，GO富集分析(A)顯示miR-200a-3p、miR-375、miR-200a-3p和miR-375的轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞黏附分子活性、細(xì)胞核與胞質(zhì)、轉(zhuǎn)移酶活性富集程度高。轉(zhuǎn)錄因子分析(B)結(jié)果表明調(diào)控CDK2基因的miRNA匹配到200個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其中EGR1、SP1、POU2F1、SP4、FOXA1是與miRNA結(jié)合強(qiáng)度最靠前的5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。

圖2 細(xì)胞組成(CC)、生物過(guò)程(BP)、分子功能(MF)的GO富集分析(A)與轉(zhuǎn)錄因子分析(B)

3 討論

細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)能紊亂可以引起肝癌細(xì)胞失控性生長(zhǎng)，本課題組前期研究證明，CDK2與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，CDK2在細(xì)胞周期調(diào)控中具有正向推進(jìn)作用，當(dāng)機(jī)體內(nèi)CDK2活性異常升高時(shí)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA合成，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞不斷增殖。miRNA是一類小RNA，自身不參與表達(dá)但能通過(guò)形成沉默復(fù)合體(RISC)對(duì)靶基因mRNA發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用。因此，我們推測(cè)在腫瘤細(xì)胞中，表達(dá)下調(diào)的miRNA可能是調(diào)控CDK2基因的靶miRNA，二者存在直接調(diào)控關(guān)系；表達(dá)上調(diào)的miRNA與CDK2基因不存在直接調(diào)控關(guān)系，可能是通過(guò)其他途徑在肝癌發(fā)生中起作用的。所以，我們初步推測(cè)miR-200a-3p、miR-375是CDK2靶miRNA，但其確切關(guān)系有待利用miRNA模擬物和抑制物干預(yù)后檢測(cè)以及熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法(Luciferase Assay)等實(shí)驗(yàn)方法做進(jìn)一步確定；miR-18a-5p和miR222-3p在肝癌中表達(dá)上調(diào)，因此初步確定其與CDK2無(wú)直接調(diào)控關(guān)系，其間接調(diào)控機(jī)制可能通過(guò)其他環(huán)節(jié)作用產(chǎn)生。通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子EGR1、SP1、POU2U1、SP4與FOXA1與差異miRNA結(jié)合強(qiáng)度排名前五。有研究表明miR-181a-5p是轉(zhuǎn)錄因子EGR1的負(fù)調(diào)控因子，它可以通過(guò)靶向EGR11/TGF-β1/Smad途徑抑制HCC中的腫瘤增殖[6]。lncRNA轉(zhuǎn)移相關(guān)的肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(MALAT1通過(guò)海綿化miR-200a-3p作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)來(lái)抑制FOXA1表達(dá)而降低甲狀腺癌的生長(zhǎng)[7]。miR-375通過(guò)直接結(jié)合3'非翻譯區(qū)(3’-UTR)負(fù)調(diào)控Sp1轉(zhuǎn)錄因子(SP1)蛋白并調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因來(lái)抑制大腸癌的侵襲和遷移[8]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-200a-3p和miR-375在食道癌等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)并且與腫瘤的發(fā)展呈負(fù)相關(guān)[9]。Chu等研究表明，miR-375在前列腺癌中具有抑制雄性激素效應(yīng)因子的基因甲基化作用，對(duì)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展具有抑制作用[10]；Wang等研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a-3p能通過(guò)靶向抑制SPAG9在腎細(xì)胞癌的表達(dá)，從而抑制腫瘤的發(fā)展并促進(jìn)其凋亡[11]；Liu等研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中，miR-375能靶向沉默Hippo 信號(hào)通路中的YAP基因的表達(dá)，從而抑制肝癌的發(fā)生[12]。關(guān)于miR-200a-3p和miR-375在調(diào)控肝癌CDK2基因表達(dá)的相關(guān)研究較少。

綜上所述，本研究表明miR-200a-3p和miR-375表達(dá)與肝癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，初步確定miR-200a-3p和miR-375是調(diào)控肝癌中CDK2基因表達(dá)的靶miRNA。本實(shí)驗(yàn)為肝癌發(fā)生機(jī)制的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。