李浩令,包智航,仰高偉,倪宇軒,王文銳,2

(蚌埠醫(yī)學(xué)院 1.癌癥轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

肝癌是臨床上發(fā)病率極高的腫瘤之一，LIHC是其中最常見的一種，并且肝細(xì)胞癌患者死亡率在全球癌癥中位居第四位[1]。與肝細(xì)胞癌相關(guān)的死亡率有逐年上升的趨勢[2]，這主要因?yàn)楦渭?xì)胞癌患者大多在晚期階段被確診，現(xiàn)有治療方法有限且治療效果不佳[3]。此外，有研究表明肝細(xì)胞癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率極高，并且肝細(xì)胞癌術(shù)后復(fù)發(fā)患者的預(yù)后效果較差[4]。因此，尋找潛在的診斷和治療肝細(xì)胞癌患者的生物標(biāo)志物尤為重要。

泛素化和去泛素化在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)定位、代謝、穩(wěn)定以及控制細(xì)胞生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[5]，而泛素特異性蛋白酶39(USP39)是去泛素化酶家族的成員之一，可以阻止蛋白質(zhì)形成泛素化，從而參與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和降解的調(diào)節(jié)，例如USP39通過去泛素化作用來調(diào)節(jié)DNA損傷相關(guān)蛋白CHK2的穩(wěn)定性，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)肺癌的細(xì)胞過程[6]。此外，USP39在癌細(xì)胞中的促生長作用已被廣泛研究，例如高表達(dá)的USP39可以通過靶向EMT和P53途徑促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移[7]；USP39蛋白可通過調(diào)控Wnt/β-catenin途徑進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[8]；此外USP39蛋白還可通過調(diào)控Akt信號(hào)通路促進(jìn)人腎細(xì)胞癌惡性增殖[9]。盡管越來越多的研究表明，USP39的異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但其在肝細(xì)胞癌中的預(yù)后價(jià)值及其生物學(xué)作用尚不清楚。

本研究對TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集進(jìn)行處理，利用生物信息學(xué)方法分析USP39表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性，進(jìn)一步預(yù)測USP39在肝細(xì)胞癌中可能參與的生物學(xué)過程。此外，我們利用腫瘤免疫評估資源(TIMER)數(shù)據(jù)庫分析USP39與免疫細(xì)胞浸潤及免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 資料來源本研究中使用的肝細(xì)胞癌數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫(https://www.cancer.gov/)和ICGC數(shù)據(jù)庫(https://icgc.org/)。采用Strawberry Perl軟件對肝細(xì)胞癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和整理，通過網(wǎng)站(https://www.perl.org/)下載安裝；使用R軟件分析包對肝細(xì)胞癌數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及可視化，通過網(wǎng)站(https://www.r-project.org/)下載安裝。

1.2 USP39在肝細(xì)胞癌組織中的差異表達(dá)從TCGA數(shù)據(jù)庫下載肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(包含50例正常組織，374例肝細(xì)胞癌組織)。同時(shí)從ICGC數(shù)據(jù)庫獲取肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(包含202例正常組織，243例肝細(xì)胞癌組織)，作為USP39差異表達(dá)的驗(yàn)證數(shù)據(jù)集。應(yīng)用Strawberry Perl軟件處理肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲取基因表達(dá)矩陣；應(yīng)用R 4.03軟件提取USP39的表達(dá)數(shù)據(jù)并利用Strawberry Perl軟件獲取USP39基因在肝細(xì)胞癌組織及其對應(yīng)正常組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)(50對配對數(shù)據(jù)來自TCGA數(shù)據(jù)庫)，然后使用limma包對USP39表達(dá)數(shù)據(jù)做差異分析，以|foldchange|>1.5、FDR<0.05表示基因表達(dá)具有差異。此外，使用TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)差異表達(dá)模塊分析USP39基因在多種癌癥中的表達(dá)情況。

1.3 USP39表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性分析應(yīng)用Strawberry Perl軟件將USP39在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中的表達(dá)數(shù)據(jù)分別與腫瘤分期，組織學(xué)分級和腫瘤大小及肝細(xì)胞癌患者生存時(shí)間合并。采用Kruskal(KS)檢驗(yàn)分析USP39表達(dá)與腫瘤分期，組織學(xué)分級和腫瘤大小之間的關(guān)系；使用Kaplan-Meier法分析USP39高低表達(dá)組之間生存率的差異，然后使用ICGC-LIHC數(shù)據(jù)集對USP39生存分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；采用單因素和多因素Cox回歸分析USP39在肝細(xì)胞癌中的預(yù)后價(jià)值。

1.4 USP39單基因富集分析根據(jù)TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中USP39表達(dá)量的中位值，將基因表達(dá)數(shù)據(jù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。應(yīng)用GSEA分析軟件以分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(Molecular Signature Database,MsigDB)中的c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt數(shù)據(jù)集作為功能基因集對USP39進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。以NES絕對值≥1.0、NOM p-val<0.05、FDRq-val<0.25為條件對USP39單基因富集結(jié)果進(jìn)行篩選。

1.5 USP39與潛在靶基因的相關(guān)性分析從USP39相關(guān)信號(hào)通路中尋找與肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的通路，應(yīng)用Strawberry Perl軟件提取USP39基因和目標(biāo)通路中的關(guān)鍵基因在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)，然后使用Spearson函數(shù)分析USP39與關(guān)鍵基因的關(guān)系。0.1≤|r|≤1.0時(shí)表示USP39與潛在靶基因具有相關(guān)性，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 TIMER數(shù)據(jù)庫分析為了更好地了解USP39在肝細(xì)胞癌中的作用，使用TIMER數(shù)據(jù)庫中的基因模塊探究USP39的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(B cells,CD4+T cells,CD8+T cells,neutrophils,macrophages,dendritic cells)水平的相關(guān)性；應(yīng)用相關(guān)性模塊分析了USP39表達(dá)與免疫浸潤細(xì)胞(Monocyte,tumor-associated macrophage,M1 macrophage,M2 macrophage,Th1,Th2)標(biāo)志物表達(dá)之間的相關(guān)性。0.1≤|r|≤1.0時(shí)表示USP39與免疫浸潤細(xì)胞標(biāo)志物具有相關(guān)性，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用R 4.03軟件以及Strawberry Perl軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。應(yīng)用非參秩檢驗(yàn)(Wilcox Test)分析USP39在肝細(xì)胞癌組織與正常組織之間的表達(dá)差異；應(yīng)用Kruskal檢驗(yàn)分析USP39表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性；應(yīng)用 Kaplan-Meier 分析USP39高低表達(dá)組之間生存率的差異；應(yīng)用單因素和多因素COX回歸模型分析USP39在肝細(xì)胞癌患者中的預(yù)后意義。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Spearson函數(shù)分析USP39與關(guān)鍵基因之間的相關(guān)性，0.1≤|r|≤1.0時(shí)表示USP39與潛在靶基因具有相關(guān)性，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 USP39在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平TIMER數(shù)據(jù)庫分析顯示USP39在膽管癌(CHOL)、食管癌(ESCA)、肺鱗癌(LUSC)、肺腺癌(LUAD)、胃癌(STAD)等腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)(圖1)。TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集分析顯示肝細(xì)胞癌組織中USP39的表達(dá)量高于正常組織(P<0.05，圖2A)；對TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中肝細(xì)胞癌組織及相對應(yīng)的正常組織的分析結(jié)果表明，USP39在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)高于配對正常組織(P<0.05，圖2B)。進(jìn)一步分析ICGC-LIHC數(shù)據(jù)集來增加正常組織數(shù)量，對243例肝細(xì)胞癌組織樣本及202例正常組織進(jìn)行分析，結(jié)果表明USP39在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)(P<0.05，圖2C)。

圖1 TIMER網(wǎng)站分析TCGA數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤類型中USP39的表達(dá)情況

2.2 USP39的表達(dá)與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果表明。USP39基因表達(dá)與腫瘤分期，組織學(xué)分級和腫瘤大小具有相關(guān)性(P<0.001，圖3)。Kaplan-Meier分析結(jié)果顯示，USP39高表達(dá)患者的生存率低于USP39低表達(dá)患者(P<0.001，圖4A)，并且ICGC-LIHC數(shù)據(jù)集生存分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了USP39高表達(dá)組肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良(P<0.001，圖4B)。單因素Cox回歸分析顯示腫瘤分期、腫瘤大小和USP39可有效預(yù)測肝細(xì)胞癌患者的生存(P<0.001，圖5A)；多因素Cox分析顯示，USP39與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良相關(guān)(P<0.001，圖5B)，可作為評價(jià)肝細(xì)胞癌患者的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因子。

圖5 單因素(A)與多因素(B)獨(dú)立預(yù)后分析

2.3 USP39單基因通路富集分析為了分析USP39在肝細(xì)胞癌中可能參與的生物學(xué)過程，我們在TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集的基礎(chǔ)上對USP39的高低表達(dá)組進(jìn)行GSEA分析。結(jié)果顯示，USP39與自噬的調(diào)節(jié)過程相關(guān)(圖6)，USP39高表達(dá)可促進(jìn)肝細(xì)胞癌組織中腫瘤細(xì)胞的自噬作用。

圖6 USP39基因的通路富集分析(部分結(jié)果)

2.4 USP39與自噬相關(guān)基因的相關(guān)性肝細(xì)胞癌組織中USP39基因與4個(gè)自噬相關(guān)基因之間的相關(guān)性分析顯示(r=0.6，r=0.59，r=0.5，r=0.6，均P<0.001，圖7)，USP39與ATG4B、ATG16L1、BIRC6和TSC1成顯著正相關(guān)。結(jié)合以上分析結(jié)果，我們推測USP39可能通過調(diào)控ATG4B、ATG16L1、BIRC6和TSC1表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬，進(jìn)而對肝細(xì)胞癌的發(fā)展產(chǎn)生促進(jìn)作用。

圖7 USP39與ATG4B(A)、ATG16L1(B)、BIRC6(C)、TSC1(D)的相關(guān)性

2.5 USP39的表達(dá)與免疫浸潤水平的關(guān)系TIMER數(shù)據(jù)庫分析顯示(圖8)，USP39表達(dá)水平與腫瘤純度具有正相關(guān)性(r=0.122，P=0.0227)；USP39表達(dá)水平與B細(xì)胞(r=0.363，P<0.001)、CD8+T細(xì)胞(r=0.215，P<0.001)、CD4+T細(xì)胞(r=0.453，P<0.001)、巨噬細(xì)胞(r=0.478，P<0.001)、中性粒細(xì)胞(r=0.402，P<0.001)以及樹突狀細(xì)胞(r=0.402，P<0.001)免疫浸潤水平成顯著正相關(guān)。

圖8 肝細(xì)胞癌中USP39的表達(dá)與免疫浸潤水平的相關(guān)性

2.6 USP39與免疫細(xì)胞標(biāo)記物間的關(guān)系采用TIMER數(shù)據(jù)庫分析USP39與免疫細(xì)胞表面標(biāo)志物間的關(guān)系。結(jié)果顯示(均P<0.05，圖9和圖10)，USP39與單核細(xì)胞標(biāo)志物(CD86、CSF1R)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage，TAM)標(biāo)志物(CCL2、CD68、IL10)、M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(NOS2、IRF5、PTGS2)和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CD163、VSIG4、MS4A4A)均呈顯著正相關(guān)。此外，USP39還與Th1細(xì)胞標(biāo)志物(STAT4、TBX21、CD4、TNF)和Th2細(xì)胞標(biāo)志物(GATA3、CXCR4、CCR8、STAT5A)具有顯著正相關(guān)的關(guān)系。

圖9 肝細(xì)胞癌中USP39與Monocyte、TAM、M1及M2的表面標(biāo)志物的相關(guān)性

圖10 肝細(xì)胞癌中USP39與Th1及Th2的表面標(biāo)志物的相關(guān)性

3 討論

肝細(xì)胞癌(LIHC)是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，其主要致病因素包括酒精中毒、藥物刺激、肥胖、乙肝病毒和丙肝病毒等[10]。肝細(xì)胞癌的治療關(guān)鍵在于早期確診以便于患者進(jìn)行有效的治療，但大部分肝細(xì)胞癌患者都在晚期被確診。因此，探索肝細(xì)胞癌可能的致病機(jī)制以及尋找肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的分子標(biāo)志物對于肝細(xì)胞癌的診斷和治療具有重要意義。

泛素特異性蛋白酶39(USP39)是一種屬于USP家族的半胱氨酸脫嘌呤酶，是剪接體復(fù)合物的組成分子之一，參與部分基因的加工過程[11]。最近，有研究報(bào)道USP39在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)并表現(xiàn)出致癌作用。例如，USP39通過促進(jìn)致癌基因HMGA2的有效剪接，進(jìn)而在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)揮致癌作用[11]；在非小細(xì)胞肺癌中USP39作為癌基因發(fā)揮作用，而且揭示了敲低USP39可以激活P53途徑進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[12]；在胰腺癌中，USP39同樣也作為癌基因發(fā)揮作用[13]。以上研究表明USP39在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著促癌作用，但其在肝細(xì)胞癌中的預(yù)后價(jià)值以及分子機(jī)制尚不清楚。

在本研究中，TIMER數(shù)據(jù)庫分析顯示，USP39在CHOL、ESCA、LUSC、LUAD和STAD等惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)。然后通過分析TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集，我們發(fā)現(xiàn)USP39基因在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)水平高于正常組織，并且在ICGC-LIHC數(shù)據(jù)集的分析中，我們驗(yàn)證了USP39在肝細(xì)胞癌中的差異表達(dá)。進(jìn)一步分析顯示，USP39與腫瘤分期、組織學(xué)分級及腫瘤大小相關(guān)，并且USP39高表達(dá)提示肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良。單因素和多因素COX分析顯示，USP39可作為評價(jià)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)。為深入研究USP39在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能及分子調(diào)控機(jī)制，我們使用GSEA軟件對USP39進(jìn)行單基因富集分析，結(jié)果顯示USP39高表達(dá)可對腫瘤細(xì)胞自噬過程產(chǎn)生促進(jìn)作用，且USP39與自噬調(diào)節(jié)過程中的關(guān)鍵基因(ATG4B[14]、ATG16L1[15]、BIRC6[16]、TSC1[17])呈顯著正相關(guān)。已有研究表明自噬作用可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長[14-17]，由此推斷USP39高表達(dá)可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬進(jìn)而調(diào)控肝細(xì)胞癌的發(fā)展。此外，我們通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)USP39與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞免疫浸潤相關(guān)，并且USP39表達(dá)與單核細(xì)胞、TAM、M1和M2巨噬細(xì)胞、Th1和Th2細(xì)胞的標(biāo)記基因表達(dá)呈正相關(guān)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)USP39在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，并且其表達(dá)與臨床病理參數(shù)、預(yù)后及免疫細(xì)胞浸潤具有相關(guān)性。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)USP39高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的自噬過程，并且其與自噬相關(guān)基因呈顯著正相關(guān)。我們推測USP39具有作為診斷肝細(xì)胞癌并預(yù)測患者預(yù)后的分子標(biāo)記物的潛力，其可能通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞自噬進(jìn)而對肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。雖然本實(shí)驗(yàn)使用生物信息學(xué)工具對USP39基因在肝細(xì)胞癌中的作用進(jìn)行深度探索，但尚需要大量基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)對本研究的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，為肝細(xì)胞癌的診斷和預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物。