黃雪芹，左勇,2*，張強(qiáng)*，徐佳，楊建飛，易媛

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000）（2.四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610101）

白酒糟是以高粱、小麥、玉米、谷物等為原料經(jīng)過發(fā)酵、蒸餾提取酒精后所產(chǎn)生的副產(chǎn)物，富含粗蛋白、酸性洗滌纖維、粗淀粉和無氮浸出物等營養(yǎng)成分[1]。利用白酒糟為原料制作有機(jī)肥料，既能解決環(huán)保問題，又可為綠色食品的生產(chǎn)提供有機(jī)環(huán)境，實(shí)現(xiàn)資源再利用。但由于酒糟中含有大量的木質(zhì)纖維素，影響堆肥腐熟度，且木質(zhì)纖維素組成多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，并有少量果膠包裹在纖維素周圍，阻礙了纖維素酶與纖維素的接觸抑制其水解。加入木聚糖酶補(bǔ)充纖維素酶，使二者產(chǎn)生協(xié)同作用[2]，可以改善具有較高木聚糖含量底物的降解。木聚糖酶的種類很多，對木聚糖的降解發(fā)揮不同的作用，其中β-1,4-內(nèi)切-D-木聚糖酶（endo-β-1,4-D-xylanase）[EC3.2.1.8][3]能將木聚糖的主鏈結(jié)構(gòu)降解。目前，木聚糖酶主要被運(yùn)用于包括工業(yè)[4]、農(nóng)業(yè)[5]以及飼料加工等多種領(lǐng)域[6]。但木聚糖酶的生產(chǎn)主要利用細(xì)菌、真菌的發(fā)酵和構(gòu)建產(chǎn)木聚糖酶工程菌的生產(chǎn)手段提高木聚糖酶產(chǎn)量使其在工業(yè)生產(chǎn)中有更廣泛的應(yīng)用。在構(gòu)建木聚糖酶工程菌的研究中，大多以大腸桿菌和畢赤酵母為宿主菌[7]，由于枯草芽孢桿菌有完善的分泌系統(tǒng)，可以分泌胞外酶，且具有生長速度較快、營養(yǎng)要求較低、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[8]。近年來，很多研究將其作為模式生物運(yùn)用到生物研究中，以過表達(dá)具有不同功能的異源蛋白[9]。通過基因工程使相關(guān)基因過表達(dá)是提高酶生產(chǎn)率的關(guān)鍵技術(shù)，再與優(yōu)化發(fā)酵工藝相結(jié)合，搖瓶和發(fā)酵罐中蛋白酶的產(chǎn)量將大大提高[10]。

本研究從酒糟中分離鑒定出的優(yōu)勢微生物為模板克隆木聚糖酶，為獲得胞外具有高酶活且生長周期短的工程菌，故用被敲除八個(gè)細(xì)胞外蛋白酶的枯草芽孢桿菌WB800 作為宿主菌表達(dá)目的基因，利用枯草芽孢桿菌的分泌型表達(dá)載體pHT43-HIS 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，它帶有IPTG 誘導(dǎo)分泌信號序列，能夠誘導(dǎo)物存在下引導(dǎo)表達(dá)外源蛋白分泌到細(xì)胞外，這樣把菌體生長和誘導(dǎo)目的蛋白分開，有利于后期高濃度發(fā)酵中高效表達(dá)目的蛋白，并進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化和耐酸性檢測，以期提高B.subtilisWB800-P7 木聚糖酶生產(chǎn)能力和適用性能，利于木聚糖酶在工業(yè)中的獲取與應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌菌株、質(zhì)粒和試劑

土壤中分離得到的Bacillus velezensisP7 菌株（ID：MH769179）纖維素酶系酶活力為：內(nèi)切葡聚糖酶酶活力2.66 IU；外切酶活力0.6 IU；β-葡聚糖苷酶0.25IU；木聚糖酶活力1.32 IU。

大腸桿菌Trans-T1 Phage Pesistant、pHT43-HIS 質(zhì)粒、B.subtilisWB800、2×Fast Pfu DNA 聚合酶、限制酶（Bam HI、Xba I）、T4DNA 連接酶，（ThermoFisher，中國上海）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；氨芐青霉素（Ampicillin），購自索萊寶生物科技有限公司；山毛櫸木聚糖，購自Sigma（美國）；其余生化試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 菌株生長基質(zhì)和條件

大腸桿菌 Trans-T1 和枯草芽孢桿菌在Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)。帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌Trans-T1和枯草芽孢桿菌在氨芐青霉素（100 μg/mL）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)?？莶菅挎邨U菌在GM培養(yǎng)基中制備感受態(tài)細(xì)胞，參考文獻(xiàn)[11]，并略做修改。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室從Bacillus velezensisP7菌株中克隆獲得的木聚糖酶xynA基因序列（GenbankNC_000964.3）設(shè)計(jì)上下游引物，即

下劃線分別為限制性內(nèi)切酶Bam HI、Xba I。用細(xì)菌基因組DNA 快速提取試劑盒提取Bacillus velezensisP7 菌株基因組。根據(jù)序列，合成引物寡核苷酸，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增。擴(kuò)增660 個(gè)堿基對（bp）片段。

使用質(zhì)粒提取試劑盒提取空質(zhì)粒，再用Bam HI和Xba I 酶切DNA 片段和空質(zhì)粒，用凝膠提取試劑盒進(jìn)行凝膠純化。用T4 連接酶連接得到重組質(zhì)粒pHT43-xynA（見圖1）。DNA 克隆，限制性酶切和大腸桿菌轉(zhuǎn)化方法均按照既定方法常規(guī)進(jìn)行[12]。通過化學(xué)方法轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒進(jìn)枯草芽孢桿菌WB800 中進(jìn)行異源表達(dá)。

圖1 pHT43-xynA 重組質(zhì)粒連接圖譜Fig.1 Plasmid map of pHT43-xynA

1.4 蛋白表達(dá)及純化電泳分析

將攜帶重組質(zhì)粒的B.subtilisWB800 在含有氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB 培養(yǎng)基中于37 ℃過夜生長。將培養(yǎng)物接種（1%）到含有氨芐青霉素（100 μg/mL）的新鮮LB 培養(yǎng)基中，并繼續(xù)培養(yǎng)直到OD600達(dá)到0.6～0.8。通過添加1 mmol/L（終濃度）異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)木聚糖酶基因異源表達(dá)，并在37 ℃下繼續(xù)孵育16 h。在8000 ×g，10 ℃條件下離心5 min，收集上清液。

（1）1向上清液中加入1 mL 已洗脫掉保護(hù)液的Ni-NTA 瓊脂糖樹脂（洗脫3 次，1 mL/min 流速），在4～8 ℃，60 r/min，2 mL/min 流速的條件下孵育12 h后加入層析柱中，分別用10、20、50、100、250、500 mmol/L 的咪唑緩沖液洗脫，有梯度的洗脫樹脂，并且分開依次的收集液體，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測。確定目的蛋白和雜志蛋白的洗脫液濃度。

（2）2確定了目的蛋白和雜質(zhì)蛋白的洗脫液濃度后。保存目的蛋白的洗脫液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的濃縮膠與質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE 梯度電泳，電泳后的蛋白膠先用固定液對凝膠處理20 min，然后用考馬斯亮藍(lán)（CBB）染色，分析重組酶的分泌表達(dá)情況SDS-PAGE 分析。最后將鎳柱保存在20%的酒精中4 ℃保存。

1.5 木聚糖酶活力測定

使用木糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用 DNS 法，即3,5-dinitrosalicylic acid 測定木聚糖酶[13]活力。木聚糖酶標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：無水木糖0.1 g（烘箱干燥），加pH 5.0 乙酸-乙酸鈉緩沖液定容至100 mL，取D-木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0 mL、0.04 mL、0.08 mL、0.12 mL、0.16 mL、0.2 mL、0.24 mL、0.28 mL、0.32 mL、0.36 mL、0.4 mL，隨后加蒸餾水定容至0.4 mL，再加入2.5 mL DNS，沸水浴10 min，冷卻后蒸餾水定容至25 mL，于波長540 nm 處測定吸光值。

木聚糖酶活力的測定：于25 mL 的具塞刻度試管里加入1 mL 的1%木聚糖溶液（由0.1 mol/L，pH 5.0的醋酸緩沖液配制）和0.1 mL 適當(dāng)稀釋酶液于50 ℃條件下靜置反應(yīng)30 min，后加入2.5 mL 的DNS 溶液搖勻煮沸10 min 后，定容至25 mL 于波長540 nm 下測定吸光度值。滅活的酶液作為空白對照。木聚糖酶一個(gè)酶活力單位（IU）定義為1 min 產(chǎn)生1 μmol 的還原性木糖所需要的酶量。酶活計(jì)算公式如下：

式中：

X——木聚糖酶活，IU；

A——酶解反應(yīng)產(chǎn)生的木糖量，利用木糖曲線得到，mg；

n——木聚糖酶液稀釋倍數(shù)；

150.13——木糖的相對分子質(zhì)量，g/moL；

30——體系反應(yīng)時(shí)間，min；

V——吸入反應(yīng)液的體積，mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示：在波長540 nm 處，0～1 mg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，吸光度OD 值和木糖濃度呈良好的線性關(guān)系，分別滿足方程y=0.3678x-0.0256，R2=0.995。

圖2 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of xylose

1.6 重組工程菌誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化及發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.6.1 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察IPTG 誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)濃度對重組菌株產(chǎn)酶的影響。以誘導(dǎo)終濃度1 mmol/L、OD600達(dá)0.6 時(shí)誘導(dǎo)為初始誘導(dǎo)條件，添加IPTG 終濃度分別為0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L 和誘導(dǎo)時(shí)機(jī)即誘導(dǎo)初始OD600分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4。將重組菌的種子液以2%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL（250 mL 的三角瓶）含100 μg/mL Amp的發(fā)酵培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)表達(dá)16 h 后，測其酶活。

1.6.2 重組菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

為提高重組工程菌的產(chǎn)木聚糖酶量，對B.subtilisWB800-P7 菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵工藝優(yōu)化。以自然pH、培養(yǎng)溫度37 ℃、接種量2%、轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵時(shí)間16 h 為基礎(chǔ)培養(yǎng)條件，首先采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案確定重組菌株產(chǎn)酶條件的最佳優(yōu)化范圍。依次對培養(yǎng)pH（磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）、溫度（25、30、33、35、37、40 ℃）、菌種的接種量（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%）、搖床轉(zhuǎn)速（140、160、180、200、220、240 r/min）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對B.subtilisWB800-P7 進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)[14]，確定其搖瓶的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Experimental factors and levels

1.7 重組酶耐酸性測定

最適作用pH 測定：將酶液加入不同pH（3～9 范圍內(nèi)，每隔0.5）的1%櫸木木聚糖底物中。測定殘余酶活力，以最高酶活作為100%，其余酶活與之相比計(jì)算相對酶活。得出適宜pH 范圍。

pH 穩(wěn)定性測定：在室溫下，預(yù)先將酶液加入到pH 范圍2～12 的緩沖液中放置2 h 后，標(biāo)準(zhǔn)條件下測定木聚糖酶的殘余酶活力來分析酶的pH 穩(wěn)定性。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用正交設(shè)計(jì)助手II V3.1 軟件設(shè)計(jì)影響酶活力表達(dá)量的各項(xiàng)組合實(shí)驗(yàn)，以pH、溫度（℃）、接種量（%）和轉(zhuǎn)數(shù)（r/min）為自變量，以酶活力（IU）為正交值進(jìn)行。每組試驗(yàn)做3 組平行，試驗(yàn)結(jié)果均以X±SD 表示。采用Origin 2018 軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組工程菌的構(gòu)建

2.1.1 重組質(zhì)粒pHT43-xynA的構(gòu)建

將克隆的Bacillus velezensisP7木聚糖酶基因片段連接到質(zhì)粒pHT43-His 上，并轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌WB800 中，成功獲得了重組B.subtilis WB800-P7。利用DNA 提取試劑盒得到野生菌的基因組，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，如圖3 所示，得到約660 bp處可見一條清晰條帶；用Bam HI和Xba I酶切空質(zhì)粒、重組質(zhì)粒，如圖4 所示，得到約8101 bp 和660 bp 的片段。

圖3 枯草芽孢桿菌木聚糖酶基因PCR 擴(kuò)增圖Fig.3 PCR amplification of xylanase gene from Bacillus subtilis

圖4 重組質(zhì)粒酶切電泳圖Fig.4 Electrophoresis of recombinant plasmid

2.1.2 枯草芽孢桿菌重組質(zhì)粒pHT43-xynA的轉(zhuǎn)化

枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率要遠(yuǎn)低于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化效率，本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)的化學(xué)轉(zhuǎn)化法的基礎(chǔ)上對感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化方法加以改進(jìn)，成功將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌感受態(tài)中，在含Amp抗性的平板上得到含有轉(zhuǎn)化子的單菌落，結(jié)果如圖5（左）。因?yàn)橘|(zhì)粒pHT43 在枯草芽孢桿菌WB800 中主要進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)，所以質(zhì)粒的復(fù)制數(shù)很低，用傳統(tǒng)的提質(zhì)粒鑒定的方法不可行，所以本實(shí)驗(yàn)采取菌落PCR 的方法對陽性重組菌進(jìn)行篩選鑒定。挑選形態(tài)光滑，大小合適的多顆單菌落，無菌接種入5 mL 含Amp 抗性的LB 培養(yǎng)基中，搖床振蕩培養(yǎng)12 h。以渾濁的菌液為模板，進(jìn)行PCR。菌落PCR 的結(jié)果如圖5（右）所示。將驗(yàn)證成功的菌液全部提取重組質(zhì)粒，然后都進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。酶切完成后，凝膠電泳并在凝膠成像系統(tǒng)中照相保存。將酶切鑒定成功的陽性轉(zhuǎn)化子提取液送至擎科生物技術(shù)有限公司（成都）測序，測序正確的陽性轉(zhuǎn)化子命名為pHT43-xynA，對應(yīng)的菌株命名為B.subtilisWB800-P7。

圖5 重組工程菌單菌落平板圖（左）、單菌落PCR 結(jié)果圖（右）Fig.5 Single colony plate of recombinant engineering bacteria(left),single colony PCR results (right)

2.2 表達(dá)產(chǎn)物及純化SDS-PAGE 分析

通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示在誘導(dǎo)16 h 后，發(fā)酵上清液和全細(xì)胞粗蛋白均在相對分子質(zhì)量約40 ku 附近出現(xiàn)一條明顯的特異性條帶，并將鎳柱純化后得到的蛋白洗脫液進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖6 所示，得到單獨(dú)的條帶了約40.0 ku，表明此純化方法能有效的純化重組蛋白。這與向亞萍等[15]研究海棲熱袍菌極耐熱木聚糖酶基因xynB在枯草芽孢桿菌Bs916 中進(jìn)行異源分泌蛋白在相對分子質(zhì)量43 ku 處有明顯的蛋白表達(dá)條帶一致。

圖6 蛋白純化電泳圖Fig.6 Electrophoretogram (SDS-PAGE) of protein purification

2.3 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

以誘導(dǎo)物終濃度1 mmol/L、OD600為0.6 時(shí)為初始誘導(dǎo)條件對重組菌B.subtilisWB800-P7 對其誘導(dǎo)。

2.3.1 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對重組木聚糖酶產(chǎn)酶影響

將重組工程菌的種子液按2%接種量轉(zhuǎn)接搖瓶后，培養(yǎng)不同時(shí)間控制初始OD600分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 時(shí)，添加終濃度為1 mmol/L IPTG，在37 ℃下發(fā)酵16 h 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，測其胞外木聚糖酶活性，結(jié)果如圖7 所示，在OD600為0.8 時(shí)加入誘導(dǎo)物IPTG 進(jìn)行誘導(dǎo)，胞外木聚糖酶活性最高，說明載有誘導(dǎo)啟動子的重組菌在進(jìn)入對數(shù)初期后即開始外源蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，提高了重組菌表達(dá)木聚糖酶的能力。

圖7 誘導(dǎo)初始OD600對胞外酶活的影響Fig.7 Effect of OD600 before induction on the extracellular activity

2.3.2 IPTG 濃度對重組木聚糖酶產(chǎn)酶影響

將菌株放置37 ℃條件下培養(yǎng)，至菌體生長濃度到OD6000.8 時(shí)，添加不同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG 0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8（mmol/L），誘導(dǎo)表達(dá)16 h，測其所產(chǎn)的胞外木聚糖酶活性，結(jié)果如圖8 所示，誘導(dǎo)濃度顯著影響木聚糖酶的表達(dá)，在終濃度較低時(shí)，木聚糖酶活性隨著IPTG 濃度的增加而增加，當(dāng)終濃度大于1.2 mmol/L 時(shí)，酶活隨著IPTG 濃度的增加而減少，且在終濃度為1.2 mmol/L 時(shí)，胞外酶活最高為2.12 IU，高濃度IPTG 會抑制工程菌產(chǎn)酶，從而導(dǎo)致酶活性下降。

圖8 IPTG 濃度對胞外酶活的影響Fig.8 Effect of IPTG concentration on the extracellular activity

2.4 重組菌B.subtilisWB800-P7 搖瓶發(fā)酵工藝研究

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

對重組工程菌B.subtilisWB800-P7進(jìn)行單因素發(fā)酵條件優(yōu)化，在其他初始培養(yǎng)條件不變的情況下，改變一個(gè)因素，獲得最適發(fā)酵培養(yǎng)條件如圖9 所示。

圖9 單因素優(yōu)化結(jié)果Fig.9 Results of the single-factor test

微生物的生長和能量代謝受其環(huán)境pH 的影響，在弱酸性或堿性的生長條件下都會導(dǎo)致菌體生長受限甚至失活，在中性或亞酸性環(huán)境中，適合菌體生長使得產(chǎn)酶量保持在高水平。菌株的產(chǎn)酶隨pH 變化情況如圖9a所示：最佳pH為7.0時(shí)，酶活力最高為2.01 IU。隨著初始pH 的增加，酶活先增加然后逐漸減少，在pH 4～5 和pH 8～9 菌株的酶活都急速的降低。

高溫會抑制細(xì)胞某些酶的活性，對細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的合成產(chǎn)生不利影響，并導(dǎo)致微生物形態(tài)、代謝的變化，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而合適的溫度可以刺激生長。溫度對菌株的產(chǎn)酶情況影響如圖9b 所示：最佳培養(yǎng)溫度為35 ℃時(shí)，酶活力最高達(dá)2.17 IU。當(dāng)溫度過低為25 ℃時(shí)，菌株生長受到抑制，保持休眠狀態(tài)，使得酶活力很低；當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，菌株的酶活力近乎失活。

接種量影響微生物的發(fā)酵周期，接種量太大，細(xì)菌繁殖時(shí)，單位體積中細(xì)菌可利用的營養(yǎng)和氧氣不足，將導(dǎo)致細(xì)菌新陳代謝異常并影響酶的合成。接種量太少時(shí)，培養(yǎng)基利用不充分而浪費(fèi)資源，并且將增加滯后期的持續(xù)時(shí)間而增加成本[16]。在其他初始培養(yǎng)條件不變的情況下，不同轉(zhuǎn)速對重組工程菌生長發(fā)酵產(chǎn)酶情況如圖9c 所示：最佳接種量為2%時(shí)，酶活最高為2.42 IU；當(dāng)接種量小于2%時(shí)，重組菌的相對酶活力僅為最高酶活力的40%；當(dāng)接種量大于2%時(shí)，酶活力呈遞減趨勢。

搖床速度和溶解氧量之間存在正相關(guān)，后者也可以反映細(xì)菌的生長。如圖9d 所示：最佳轉(zhuǎn)速為160 r/min 時(shí)酶活力最高。轉(zhuǎn)速小于160 r/min 時(shí)，物質(zhì)不均勻混合，降低了細(xì)菌的產(chǎn)量，使得酶活降低。當(dāng)轉(zhuǎn)速大于160 r/min 時(shí)，溶解氧的量顯著增加，導(dǎo)致大量代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，影響細(xì)菌的生長，同時(shí)振蕩培養(yǎng)的剪切力過大，使得菌株產(chǎn)酶活力均下降。

2.4.2 發(fā)酵產(chǎn)酶條件的正交優(yōu)化

本研究用篩選到的野生Bacillus velezensis進(jìn)行木聚糖酶基因克隆，構(gòu)建B.subtilisWB800-P7 工程菌產(chǎn)木聚糖酶，在最佳的誘導(dǎo)條件下，不改變其他培養(yǎng)條件，利用LB 培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵上清酶活力為2.56 IU。采用L9(34)正交表，直觀分析考察重組工程菌培養(yǎng)條件pH、溫度、接種量、轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響。Rj 表示為Kij 最大、最小值之差。Rj 越大，表示該因素水平變化對該實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，該影響因素越重要；反之，Rj 越小，該因素越不重要。從表2 可以看出，對木聚糖酶活力產(chǎn)生影響的水平主次因素順序?yàn)锽（溫度）＞D（轉(zhuǎn)速）＞C（接種量）＞A（pH），在發(fā)酵過程中，溫度是影響細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)表達(dá)正確折疊和易位的關(guān)鍵因素[17]，在35 ℃的溫度下，B.subtilisWB800-P7 可以獲得較高的生長速率和細(xì)胞密度，提高了蛋白質(zhì)合成的速度。B.subtilisWB800-P7 可以獲得較高的生長速率和細(xì)胞密度，提高了蛋白質(zhì)合成的速度[18]。通過實(shí)驗(yàn)可以得出的重組工程菌的最適培養(yǎng)條件為A1B2C2D2，即pH 6.0、溫度35 ℃、接種量2%、轉(zhuǎn)速160 r/min，在此工藝條件下，木聚糖酶活力預(yù)測可達(dá)到4.11 IU，經(jīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，得到實(shí)際酶活力為4.21 IU，與優(yōu)化前相比，酶活提高了64.45%，比野生菌提高了2.19 倍。田艷杰等[18]研究的利用真菌（黑曲霉）木聚糖酶xynZF-318基因構(gòu)建枯草芽孢工程菌所產(chǎn)實(shí)際酶活力0.359 U/mL（最優(yōu)的發(fā)酵條件為：接種量為1.2%、裝液量為20 mL、種齡為11 h、培養(yǎng)溫度為37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min 下）。王停停等[19]研究源于Paenibacillus campinasensisG1-1 的木聚糖酶編碼基因成功整合到畢赤酵母GS115 基因組，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下胞外重組酶活達(dá)到707.2 IU/mL，屬于弱堿性酶，主要應(yīng)用釀酒及造紙等行業(yè)。周煌凱等[20]研究從耐堿性木聚糖酶高產(chǎn)短小芽孢桿菌BYG5-20 中克隆得到帶有自身啟動子的木聚糖酶基因xynA，將其構(gòu)建在大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pGJ148 中得到重組質(zhì)粒pGJ148-xynA。采用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pGJ148-xynA轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌1A747中，得到重組菌B.GJ148-xynA，然后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)以及培養(yǎng)基的優(yōu)化。重組菌GJ148-xynA發(fā)酵上清液中木聚糖酶酶活可達(dá)93.32I U/mL。產(chǎn)生如此差異可能是因?yàn)閬碓床煌幕蛟诓煌谋磉_(dá)載體中的表達(dá)效果不一樣，以及不同酶性質(zhì)的基因表達(dá)量也不同，還有酶活的測定方法存在差異性。但發(fā)酵條件的優(yōu)化均起到了提高酶活力的效果。

表2 正交試驗(yàn)分析Table 2 Orthogonal test analysis

2.5 重組木聚糖酶耐酸性

將重組B.subtilisWB800 菌株在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下產(chǎn)的木聚糖酶發(fā)酵上清液，在不同pH（3.0～9.0）的1%木聚糖底物溶液在50 ℃水浴反應(yīng)30 min后測定重組酶的水解活力。如圖10，得到最適反應(yīng)pH 為5.0。重組木聚糖酶經(jīng)pH 2.0～12.0 處理2 h 后，測其酶活如圖11 所示，在堿性條件下，酶活性降低。在酸性到中性條件下，其殘余酶活力是原始酶活力的80%以上，與文獻(xiàn)報(bào)道[21]的解淀粉芽抱桿菌產(chǎn)木聚糖酶在pH 為5.0～6.0 時(shí)有較高的酶活性，在37 ℃，pH 5.0、pH 5.0～7.0 條件下培養(yǎng)1 h，測定酶活力，殘余酶活性分別保持在68%、50%以上相比，在酸性條件下的耐受性更高，且對pH 有較廣的耐受范圍。

圖10 pH 對木聚糖酶的影響Fig.10 Effect of pH value on xylanase

圖11 木聚糖酶的pH 穩(wěn)定性Fig.11 The PH stability of xylanase

關(guān)于耐酸性的木聚糖酶，研究較多的是真菌表達(dá)系統(tǒng)，如王金華[22]研究黑曲霉（Aspergillus nigervarniger strainN402）耐酸內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶在酵母中的表達(dá)，其最適溫度是37 ℃，木聚糖酶的最適作用pH 為4.0 在pH 為3.0～5.0 的范圍內(nèi)，木聚糖酶的活性較高，當(dāng)pH＜2.0 和pH＞6.0 時(shí)，木聚糖酶活性急劇下降（低于30%），說明其有較廣泛的pH 穩(wěn)定范圍。由于篩選環(huán)境的不同酶學(xué)性質(zhì)會產(chǎn)生明顯差異，例如張偉等[23]構(gòu)建極耐熱枯草芽孢桿菌木聚糖酶工程菌的最適溫度達(dá)到86 ℃。通常情化下，真菌中的木聚糖酶在酸性到中性中間比較穩(wěn)定。而細(xì)菌中的木聚糖酶可以在堿性條件下比較穩(wěn)定。而本研究從呈弱酸性酒糟（pH 3～4）中篩選出耐酸的優(yōu)勢內(nèi)源微生物，以此為親本構(gòu)建了能產(chǎn)耐酸木聚糖酶枯草芽孢桿菌工程菌且能直接將重組酶分泌到胞外，在酸性條件下，其殘余酶活力是原始酶活力的80%以上，對pH 有較廣的耐受范圍。

3 結(jié)論

3.1 以酒糟篩選出產(chǎn)木聚糖酶的內(nèi)源微生物野生Bacillus velezensisP7 為目標(biāo)菌株，利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了大腸-枯草芽孢穿梭質(zhì)粒載體pHT43-xynA后導(dǎo)入枯草芽孢桿菌WB800 中，通過SDS-PAGE 電泳分析，在40 ku 附近出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，驗(yàn)證成功構(gòu)建重組B.subtilisWB800-P7。

3.2 采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)分析驗(yàn)證重組菌降解能力與酶活力。研究發(fā)酵階段各因素對工程菌酶活的影響，得出各因素的影響程度分別為：溫度＞轉(zhuǎn)速＞接種量＞pH。通過誘導(dǎo)和發(fā)酵條件的優(yōu)化，最優(yōu)IPTG誘導(dǎo)條件下即終濃度為1.2 mmol/L，起始的誘導(dǎo)OD600為0.8，最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件：pH 6.0、培養(yǎng)溫度35 ℃、接種量2%、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min 下，發(fā)酵16 h 后測得到實(shí)際最大酶活力4.21 IU，與優(yōu)化前相比，酶活力提高了64.45%。證明優(yōu)化成功提高了工程菌的酶活，為后期高密度發(fā)酵提供基礎(chǔ)發(fā)酵條件。

3.3 重組酶耐酸性研究得出最佳作用pH 為5.0，在酸性到中性條件下（pH 5.0～7.0），其殘余酶活力是原始酶活力的80%以上。這些特性預(yù)示在木聚糖酶具有應(yīng)用潛力，為該重組酶在酒糟堆肥生產(chǎn)的實(shí)際應(yīng)用中提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)，具有一定應(yīng)用價(jià)值，且為后期的試驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。