苗儼龍，龔詩(shī)媚，王凱，趙雷，涂京霞，楊青，王玉海，胡卓炎*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）（2.廣州南沙珠江啤酒有限公司，廣東廣州 511462）

啤酒是以大麥芽、啤酒花為原料，由啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiar）發(fā)酵而成[1]。啤酒富含碳水化合物，氨基酸，礦物質(zhì)以及多酚類物質(zhì)，適當(dāng)飲用啤酒具有調(diào)節(jié)免疫，預(yù)防心血管疾病等作用[2-3]。近年精釀（工坊）啤酒在啤酒市場(chǎng)上呈快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，其中水果啤酒是工坊啤酒中最受歡迎的品類之一，兼具啤酒的清爽口感，水果獨(dú)特的香甜風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)特性而深受消費(fèi)者喜愛[4-5]。研究表明在啤酒釀造工藝中添加枸杞[6]、山茱萸[7]、沙棘[8]等可以提高成品啤酒的多酚含量和抗氧化活性。天然果蔬原料的添加和活酵母的存在賦予工坊啤酒新的感官特性和多樣性，同時(shí)保留并提高了更多生物活性物質(zhì)的含量[9]。添加枸杞釀造的啤酒中的蘆丁和2-O-β-D-吡喃葡萄糖-L-抗壞血酸含量較高[6]，添加山茱萸釀造的啤酒中含有豐富的環(huán)烯醚萜類[7]，添加茄子皮釀造的啤酒中富含花青素[10]等。除此之外，還有研究人員探究了加入山楂、榲桲和柿子等對(duì)成品啤酒理化性質(zhì)的影響[11-13]。果蔬等天然原料中含有的生物活性物質(zhì)，不僅有可能減少酒精對(duì)人體機(jī)體的氧化和毒性作用，同時(shí)也可以改善啤酒品質(zhì)指標(biāo)，防止微生物污染等[14]。

荔枝是一種熱帶和亞熱帶水果，果肉風(fēng)味獨(dú)特，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的糖類、氨基酸、維生素等[15]。研究表明荔枝果肉中具有豐富的多糖及多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、降血脂、護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)等功效[16]。此外，荔枝中含有豐富的γ-氨基丁酸，是蘋果、獼猴桃等水果的100 倍[17,18]。研究表明γ-氨基丁酸能夠作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)參與大腦調(diào)節(jié)，具有抗焦慮、降血壓、調(diào)節(jié)心血管健康，預(yù)防慢性酒精相關(guān)疾病等功效[19]。由于成熟期集中，加工壓力大、要求高，不耐貯藏等原因，荔枝加工產(chǎn)品種類少，仍以荔枝干，荔枝罐頭，荔枝汁為主，不足以體現(xiàn)荔枝作為一種傳統(tǒng)珍稀水果的市場(chǎng)價(jià)值和優(yōu)勢(shì)[20,21]。

本研究探討了原麥汁濃度、荔枝果漿和啤酒花添加量對(duì)荔枝啤酒理化性質(zhì)的影響，在此基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面（response surface methodology，RSM）法對(duì)荔枝啤酒釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化，為荔枝啤酒開發(fā)提供理論依據(jù)，有助于綜合利用荔枝資源，促進(jìn)荔枝深加工產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展，延長(zhǎng)荔枝產(chǎn)業(yè)鏈。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荔枝（Litchi chinensisSonn.），品種為黑葉，產(chǎn)地為廣東，成熟鮮果采后經(jīng)挑選清洗于-18 ℃下凍藏備用；大麥芽，購(gòu)于保定歐麥麥芽公司；啤酒酵母S-23，法國(guó)Fermentis 公司；啤酒花，美國(guó)雅基瑪酒花公司。甲醇、無(wú)水乙醇、無(wú)水醋酸鈉、碳酸鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

數(shù)字式折射儀，日本ATAGO 公司；TUV-2600紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；LRH-50CL 培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DMA 4500 啤酒分析儀，奧地利Anton Paar 公司；TGL-20M 離心機(jī)，湖南湘儀公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 荔枝啤酒制作工藝

荔枝果漿制備：凍藏荔枝解凍至0～5 ℃左右，在低溫下去皮去核，果肉經(jīng)破碎打漿；荔枝啤酒制作工藝參考Ducruet 等[5]和Kawa-Rygielska 等[6]的方法，并略作修改：

麥芽→粉碎→糖化（料水比：1:3.5；分步糖化：52 ℃ 30 min；66 ℃ 60 min；76 ℃ 10 min）→洗糟、過(guò)濾，獲得麥汁→煮沸30 min（煮沸期間添加啤酒花，煮沸10 min 時(shí)添加苦型啤酒花，煮沸25 min 時(shí)添加香型啤酒花，比例為1:1）→冷卻至25 ℃→接種啤酒酵母0.6 g/L（酵母提前在25 ℃無(wú)菌水中活化30 min 備用）→投料荔枝果漿→主發(fā)酵，在2 L 的玻璃發(fā)酵罐中進(jìn)行，12 ℃下糖度連續(xù)48 h 無(wú)變化→升溫至18 ℃進(jìn)行雙乙酰還原，至雙乙酰含量≤0.10 mg/L→分離發(fā)酵液，按6 g/L 計(jì)算葡萄糖加入量，混勻→裝入250 mL 棕色啤酒瓶，12 ℃下進(jìn)行瓶?jī)?nèi)二次發(fā)酵14 d→ 4 ℃ 貯藏

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

以感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)為指標(biāo)，按照以下步驟進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

原麥汁濃度：固定啤酒花添加量0.4 g/L，荔枝添加量為20%（V/V）?？疾觳煌溨瓭舛龋?、10、12、14 和16oP）對(duì)成品啤酒理化特性和感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)的影響。

荔枝果漿添加量：固定原麥汁濃度10oP，啤酒花添加量0.4 g/L?？疾觳煌笾麧{添加量為5%（V/V）、10%（V/V）、15%（V/V）、20%（V/V）和25%（V/V）時(shí)對(duì)成品啤酒理化特性和感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)的影響。

啤酒花添加量：固定原麥汁濃度10oP，荔枝添加量為20%（V/V）?？疾觳煌【苹ㄌ砑恿浚?.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 g/L）對(duì)成品啤酒理化特性和感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，利用Design-Expert 8.0軟件Box-Behnken 設(shè)計(jì)，以A（原麥汁濃度）、B（荔枝果漿添加量）、C（啤酒花添加量）為變量，以感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的中心組合實(shí)驗(yàn)，每組重復(fù)三次，取其平均值。因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Variables and levels used in Box-Behnken design

1.2.4 啤酒理化指標(biāo)測(cè)定

樣品預(yù)處理：超聲15 min 除氣；4 ℃條件下10000 r/min 離心10 min，過(guò)濾，備用。啤酒發(fā)酵度、酒精度、殘?zhí)蔷捎冒矕|帕DMA 4500 啤酒分析儀測(cè)定。啤酒泡持性、苦度按照《GB/T 4928-2008 啤酒分析方法》測(cè)定。

1.2.5 啤酒感官評(píng)價(jià)

由10 名經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的具有啤酒品評(píng)經(jīng)驗(yàn)的人員組成感官評(píng)價(jià)小組，以外觀、泡沫、香氣、口味為評(píng)價(jià)因素。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2 所示。

表2 荔枝啤酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory scoring criteria of the litchi craft beer

1.2.6 微生物指標(biāo)

大腸桿菌：參照《GB4789.3-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》進(jìn)行測(cè)定；金黃色葡萄球菌和沙門氏菌：參考《GB 29921-2013 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2017 軟件和SPSS Statistics 19.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。差異性檢驗(yàn)使用Duncan’s 法，p＜0.05 表示差異具有顯著性。采用Design-Expert 8.0數(shù)據(jù)處理專家進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 原麥汁濃度對(duì)荔枝啤酒發(fā)酵特性的影響

不同原麥汁濃度對(duì)荔枝啤酒的發(fā)酵特性具有顯著影響（p＜0.05），如表3 所示。

表3 原麥汁濃度對(duì)荔枝啤酒理化性質(zhì)的影響Table 3 The effect of original extract level on fermentation characteristics of litchi craft beer

結(jié)果表明，隨原麥汁濃度增加，啤酒發(fā)酵度降低，殘?zhí)呛可?，酒精度增加；泡持性、苦度均隨麥汁濃度增加而升高，但感官評(píng)分并沒有隨原麥汁濃度增高而增加，10oP 的荔枝啤酒感官評(píng)分最高，為75.40分。上述結(jié)果的原因可能是原麥汁濃度越高，氮源和碳源含量增加，導(dǎo)致更多乙醇生成，發(fā)酵度升高。汪中世[22]研究了8～16oP原麥汁濃度對(duì)藍(lán)莓啤酒的影響，結(jié)果表明成品藍(lán)莓啤酒的酒精度隨原麥汁濃度增加而增加，這與本研究結(jié)果一致。王松廷[23]比較了8、12、15和20oP的原麥汁濃度對(duì)西瓜啤酒理化指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)成品西瓜啤酒的殘?zhí)呛侩S原麥汁濃度升高而升高，這與本文研究結(jié)果一致；但成品西瓜啤酒的發(fā)酵度隨原麥汁濃度升高而升高，這和本研究結(jié)果不符，這可能是因?yàn)樗梦鞴媳旧砗橇枯^低，實(shí)驗(yàn)所用酵母及發(fā)酵工藝不同的原因造成的。麥汁濃度增加，會(huì)使得發(fā)酵液粘度增大，可能不利于酵母與底物作用，導(dǎo)致殘?zhí)橇可遊24]。麥汁濃度越高，泡持蛋白含量增加，泡持性增強(qiáng)[25]。綜合比較，選擇原麥汁濃度8、10、12oP 進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 荔枝添加量對(duì)荔枝啤酒發(fā)酵特性的影響

不同荔枝果漿添加量對(duì)啤酒的發(fā)酵特性具有顯著影響（p＜0.05），如表4 所示。

表4 荔枝果漿添加量對(duì)荔枝啤酒理化性質(zhì)的影響Table 4 The effect of litchi juice addition level on fermentation characteristics of litchi craft beer

隨荔枝果漿添加量增多，發(fā)酵度和酒精度升高，殘?zhí)恰⑴莩中?、苦度降低。荔枝果漿添加量為15%（V/V）時(shí)，感官評(píng)分最高。這可能是因?yàn)槔笾χ泻胸S富的可發(fā)酵糖類如葡萄糖和果糖，而麥汁中主要是麥芽糖，當(dāng)葡萄糖增多時(shí)，會(huì)遏制酵母吸收其他糖類，促進(jìn)酵母產(chǎn)生更多乙醇[26]。汪中世[22]和Kawa-rygielska[7]等研究發(fā)現(xiàn)添加藍(lán)莓和山茱萸釀造的啤酒發(fā)酵度增大，酒精度增加，殘?zhí)墙档停@與本研究結(jié)果一致。Martínez[13]比較了75%、50%、25%比例添加柿子汁發(fā)酵對(duì)成品啤酒品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)成品啤酒的酒精度隨柿子汁添加比例添加增加而顯著增加，酒精度最高是75%比例組，不添加柿子汁的對(duì)照組最低，這和本研究結(jié)果基本相符。王松廷[23]探究了5%到30%范圍的西瓜汁添加量對(duì)成品啤酒的影響，發(fā)現(xiàn)隨西瓜汁添加量升高，成品啤酒的殘?zhí)墙档停l(fā)酵度升高，這和本研究結(jié)果一致，但酒精度呈降低趨勢(shì)，和本研究結(jié)果不符這可能是因?yàn)槲鞴虾屠笾ο啾?，含糖量低，而越高比例的西瓜汁投入，降低了本身麥芽汁的濃度，體系中總的可發(fā)酵糖含量降低，使得酒精度呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。荔枝果漿的添加，降低了苦味質(zhì)濃度，相對(duì)減少了酒花中穩(wěn)定泡沫的物質(zhì)如律草酮和泡持蛋白的含量，使得泡持性逐漸下降[27]。綜合比較，選擇荔枝添加量10%（V/V）、15%（V/V）和20%（V/V）進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 啤酒花添加量對(duì)荔枝啤酒發(fā)酵特性的影響

啤酒花添加量對(duì)啤酒的發(fā)酵度、殘?zhí)呛途凭葻o(wú)顯著影響（p＞0.05），對(duì)成品啤酒的泡持性和苦度影響顯著（p＜0.05），如表5 所示。

表5 啤酒花添加量對(duì)荔枝啤酒發(fā)酵特性的影響Table 5 The effect of hop addition level on fermentation characteristics of litchi craft beer

隨啤酒花用量提高，泡沫持久性、苦度值均顯著增加。啤酒花的添加可以有助于提升泡沫穩(wěn)定性，提高多酚含量，抑制老化前驅(qū)物的生成，增強(qiáng)成品啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性[28]。但啤酒花用量越高，苦度值也相應(yīng)升高，會(huì)導(dǎo)致苦味不協(xié)調(diào)，可能會(huì)覆蓋荔枝果香[22]。綜合比較啤酒花添加量對(duì)荔枝啤酒發(fā)酵特性和感官特性的影響，選擇酒花添加量0.3、0.4 和0.5 g/L 進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.2 荔枝啤酒工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 回歸模型的建立

選擇原麥汁濃度（A）、荔枝果漿添加量（B）、啤酒花添加量（C）為三個(gè)因素，感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)（Y）為響應(yīng)指標(biāo)，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析，試驗(yàn)結(jié)果和方差分析見表6 和表7。將表6 的數(shù)據(jù)用Design.Expert 8.0 軟件進(jìn)行二次線性回歸擬合，得到如下回歸方程：

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 The design and result of response surface experiment

表7 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果模型方差分析Table 7 Variance analysis of response surface method

由該方程知，二次項(xiàng)A2、B2、C2系數(shù)均為負(fù)，說(shuō)明該方程存在最大值。由表7 可知，二次回歸模型達(dá)到極顯著水平（p＜0.01）,模型的決定系數(shù)R2為0.9814.說(shuō)明該模型能解釋98.14%響應(yīng)值的變化，失擬項(xiàng)P值不顯著，說(shuō)明該模型擬合程度較好，試驗(yàn)結(jié)果具有良好的準(zhǔn)確度與可靠性。該模型變異系數(shù)CV 為2.23，說(shuō)明模型的重現(xiàn)性較好，可用于分析與預(yù)測(cè)不同工藝條件下荔枝啤酒的綜合評(píng)分。由回歸模型的F值可知各參數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響大小為荔枝果漿添加量＞啤酒花添加量＞原麥汁濃度。

2.2.2 交互作用分析

各工藝因素交互項(xiàng)對(duì)感官評(píng)分的影響作用結(jié)果見圖1。等高線的密集程度反映了試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響作用[29]。從圖1 中可以看出原麥汁濃度、荔枝添加量、酒花添加量三個(gè)因素兩兩之間均具有較強(qiáng)的交互作用，等高線呈橢圓形，響應(yīng)面為凸形，有最大值。從中還可以看出，等高線沿荔枝添加量軸向最密集，沿原麥汁濃度軸向的等高線相對(duì)稀疏，沿酒花添加量的等高線最稀疏。表明荔枝添加量對(duì)感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)的影響最大，其次是原麥汁濃度，最后是酒花添加量，這與前述的方差分析結(jié)果相符。

圖1 各因素交互作用對(duì)荔枝啤酒感官評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.1 Response surface plots showing the effect of original gravity,the addition of hop amount and litchi amount on the sensory scores

2.2.3 工藝優(yōu)化及驗(yàn)證

用Design Expert 8.0 軟件對(duì)表6 中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以啤酒的感官分?jǐn)?shù)最高為目標(biāo)，運(yùn)行優(yōu)化程序獲得優(yōu)化工藝參數(shù)條件為原麥汁濃度9～11oP、荔枝果漿添加量11%（V/V）～15%（V/V）、啤酒花添加量0.39～0.44 g/L，此條件下啤酒的感官評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)≥78，如圖2所示。綜合考慮因素及實(shí)際生產(chǎn)條件，確定原麥汁濃度10oP，荔枝果漿添加量15%，啤酒花添加量0.4 g/L為最佳優(yōu)化工藝參數(shù)，重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)三次，荔枝啤酒的感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)平均為78.10 分，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相符，具有荔枝果香的特征。該工藝下的荔枝啤酒理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)如表8 所示。

圖2 荔枝啤酒工藝參數(shù)的優(yōu)化條件Fig.2 Optimum conditions of brewing parameter for litchi craft beer

表8 荔枝啤酒理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)Table 8 The physicochemical and microbial parameters of finished litchi craft beer

3 結(jié)論

在對(duì)原麥汁濃度、荔枝果漿添加量和啤酒花添加量三種單因素對(duì)啤酒的發(fā)酵特性和品質(zhì)指標(biāo)影響的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)荔枝精釀啤酒釀造工藝進(jìn)行優(yōu)化，綜合因素和實(shí)際生產(chǎn)優(yōu)選最佳工藝條件為：原麥汁濃度10oP，荔枝果漿添加量15%（V/V），酒花添加量0.40 g/L，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，荔枝啤酒感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)平均為78.10 分，與預(yù)測(cè)值相符，該工藝下獲得的成品啤酒荔枝果香明顯，口味純正，泡沫細(xì)膩。響應(yīng)面法可以用于優(yōu)化荔枝啤酒釀造工藝，具有一定的準(zhǔn)確性和可靠性。研究結(jié)果為荔枝深加工產(chǎn)業(yè)提供了一條新的途徑。啤酒體系復(fù)雜，其整體風(fēng)味是多種物質(zhì)共同作用的結(jié)果，荔枝啤酒的風(fēng)味和適飲性，還需結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)；添加荔枝對(duì)啤酒多酚種類，貯存穩(wěn)定性和功能特性的影響亟需進(jìn)一步研究。