蔣利明, 田大偉, 劉勝來, 張羽

1天津醫(yī)科大學(xué)中新生態(tài)城醫(yī)院外科(天津 300467)； 2天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科(天津 300211)

膀胱癌源自膀胱上皮細胞，研究顯示，膀胱癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率處于全部惡性腫瘤的前10位，在我國的發(fā)病率處于泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的首位，且其發(fā)病率呈現(xiàn)為逐年升高的趨勢[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示[3]，膀胱癌可發(fā)生與各個年齡段，多發(fā)于65歲以上男性，男性高于女性，但目前受多種因素的影響，膀胱癌的發(fā)病人群逐漸年輕化，嚴(yán)重影響著患者的生存質(zhì)量和生命健康。目前臨床上對膀胱癌的發(fā)病機制尚不完全明確，且缺乏特異性評估患者疾病進展的指標(biāo)，基于此背景，在本研究中，分析P21活化激酶6(PAK6)、鋅指蛋白217(ZNF217)、G蛋白偶聯(lián)受體48(GPR48)在膀胱癌演進過程中的表達變化，為臨床上膀胱癌的診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年12月至2019年12月于我院就診且行手術(shù)治療的138例膀胱癌患者，其中男67例，女71例，年齡35～68歲，平均(48.93±15.67)歲，腫瘤直徑：≥5 cm 68例，<5 cm 70例；低分化84例，中分化32例，高分化22例；臨床分期：Ta期38例，T1期27例，T2期22例，T3期29例，T4期22例；42例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；浸潤深度：肌層浸潤73例，非肌層浸潤65例。并對患者行為期6個月的隨訪統(tǒng)計復(fù)發(fā)情況，其中復(fù)發(fā)26例，未復(fù)發(fā)112例。所有患者及家屬均對本次研究知情，簽署知情同意書，并經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理學(xué)組織學(xué)確診為膀胱尿路上皮癌；(2)均未接受過放療、化療、免疫治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他腫瘤者；膀胱手術(shù)史者；(2)感染者；心、肺、肝等重要臟器障礙者；(3)接受過免疫、放化療者。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 取手術(shù)切除的膀胱癌組織及癌旁組織(距離癌基底邊緣≥5.0 cm正常膀胱組織)標(biāo)本，在10%的甲醛溶液中固定，脫水、包埋后，制作5 μm組織切片，設(shè)置恒溫箱溫度為58℃，烘烤 2 h，在二甲苯中脫蠟處理30 min，然后浸在梯度乙醇中各5 min，之后用無菌蒸餾水洗滌5 min。加入檸檬酸鈉抗原修復(fù)液在沸水中水浴20 min，冷卻到室溫后用PBS沖洗3次(每次5 min)。分別滴加PAK6、ZNF217、GPR48抗體(1∶200)，在4℃的濕盒中過夜保存，第2天將濕盒取出后復(fù)溫處理1 h，采用PBS洗片3次(每次5 min)。之后加入二氨基聯(lián)苯胺(1∶50)進行顯色處理1 min，最后加入蒸餾水反應(yīng)終止。加入蘇木素進行復(fù)染，鹽酸乙醇分化后，梯度乙醇進行脫水，二甲苯?jīng)_洗片3次直至透明，采用中性樹脂封片處理，顯微鏡下觀察免疫組化染色情況。隨機選取5個視野，所有病理切片均由2位以上經(jīng)驗豐富的醫(yī)師采用雙盲法進行診斷。依據(jù)染色程度和染色細胞百分比進行評估：陽性細胞數(shù)<10%為-，10%～25%為+，26%～75%為++，>75%為+++。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-PCR)法 采用RT-PCR法檢測癌組織、癌旁組織中PAK6、ZNF217、GPR48 mRNA的表達量，取癌組織、癌旁組織，利用Trizol法提取癌組織、癌旁組織總RNA，使用紫外分光光度儀檢測所提取的RNA純度，總RNA純度鑒定運用聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。利用PCR試劑盒合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄：14 μL模板RNA、2 μL Enzyme mix，4 μL 5×RT緩沖液，補至20 μL，PCR檢測儀42℃ 1 h、95℃ 5 min，之后將所合成的cDNA置于-20℃環(huán)境下保存。反應(yīng)體系為：8μL cDNA模板、10 μL SYBRP Green mix、2 μL PCR Primer mix。反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計算癌組織、癌旁組織PAK6、ZNF217、GPR48 mRNA表達量。PAK6引物序列：上游：5′-CCCACCCCAAACCCTATCT-3′，下游：5′-ACACATGGATGCCTGTGACC-3′；ZNF217引物序列：上游：5′-ATGTTACTCCTCCTCCGGATG-3′，下游：5′-ACACTTGGCCTGTATCTCA-3′；GPR48引物序列：上游：5′-TGTTTCAACCTTTTAAAGACTGTAGC-3′，下游：5′-TAAAGGACTTAATGCCAAATGTGAT-3′；β-actin引物序列：上游：5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′，5′-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3′。

2 結(jié)果

2.1 PAK6、ZNF217、GPR48在膀胱癌組織、癌旁組織中的表達情況比較 與癌旁組織相比，癌組織中PAK6表達量顯著降低，ZNF217、GPR48表達量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 PAK6、ZNF217、GPR48在膀胱癌組織、癌旁組織中的表達情況比較

圖1 PAK6、ZNF217、GPR48在膀胱癌組織、癌旁組織中的表達(免疫組化，×200)

2.2 PAK6、ZNF217、GPR48在膀胱癌演進過程中的表達情況分析 PAK6、ZNF217、GPR48表達與膀胱癌患者性別、年齡、腫瘤直徑無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；PAK6、ZNF217、GPR48表達與膀胱癌患者分化程度、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、復(fù)發(fā)情況相關(guān)，與中高分化、Ta～T1期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、非肌層浸潤、未復(fù)發(fā)患者相比，低分化、T2～T4期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤、復(fù)發(fā)患者的PAK6表達量降低，ZNF217、GPR48表達量升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 PAK6、ZNF217、GPR48在膀胱癌演進過程中的表達情況分析

2.3 PAK6、ZNF217、GPR48之間相關(guān)性分析 PAK6、ZNF217、GPR48之間相關(guān)性分析顯示，PAK6與ZNF217之間呈負相關(guān)(r=-0.219，P=0.010)；PAK6與GPR48之間呈負相關(guān)(r=-0.309，P=0.001)；ZNF217與GPR48之間呈正相關(guān)(r=0.193，P=0.023)。見圖2。

圖2 PAK6、ZNF217、GPR48之間的相關(guān)性分析

3 討論

部分研究認為，膀胱癌的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，屬于一種較為龐大、復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，在各種因素的刺激下，促進腫瘤細胞異常增殖、遷移，增殖失控，最終誘導(dǎo)腫瘤的進一步進展[4]。本研究為尋找促進膀胱癌演進的敏感指標(biāo)，分析PAK6、ZNF217、GPR48在膀胱癌演進過程中表達變化，明確三者是否參與此病的進展，為臨床上此病的診治提供參考。

P21活化激酶(PAKs)屬于一種在進化上較為保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，屬于小G蛋白Rho家族Cdc42、Rac1的下游靶向因子，臨床上根據(jù)其結(jié)構(gòu)和序列同源性分為兩類，即為包括PAK1、PAK2、PAK3在內(nèi)的Ⅰ類PAKs和包括PAK4、PAK5、PAK6在內(nèi)的Ⅱ類PAKs，與腫瘤細胞的運動、生存、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞遷移、周期變化等生物學(xué)行為相關(guān)[5-7]。PAK6屬于PAKs家族成員之一，屬于一種與雄激素受體發(fā)生相互作用的激酶蛋白，其活性受p38 MAPK、MKK6所調(diào)控，具有抑制雄激素受體介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄過程[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，PAK6在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有雙重作用，在肺癌、前列腺癌、胰腺癌等癌組織中呈現(xiàn)為異常高表達，促進腫瘤細胞增殖失控，促進疾病進展；在腎透明細胞癌中呈現(xiàn)為異常低表達。研究顯示[11]，PAK6可經(jīng)雄激素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，PAK6在膀胱癌組織中低表達，且與患者分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、復(fù)發(fā)情況相關(guān)，此結(jié)果提示PAK6可能經(jīng)雄激素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路刺激腫瘤細胞異常增殖，進而促進疾病進展，在此病的演進過程中具有重要的意義。

ZNF217屬于kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，具有1個富含脯氨酸基序、8個C2H2鋅指基序，可經(jīng)過與其特定的DNA序列結(jié)合后對特定的基因表達進行調(diào)控[12]。有研究顯示[13-14]，ZNF217同時也是一種組蛋白去乙?；笍?fù)合物的組成蛋白，可經(jīng)參與多個c端結(jié)合蛋白復(fù)合物抑制相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄過程。臨床研究發(fā)現(xiàn)，ZNF217在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的意義，經(jīng)介導(dǎo)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與惡性腫瘤的演進過程，ZNF217可經(jīng)促進ErbB3表達降低，抑制乳腺癌細胞增殖[15]。ZNF217可經(jīng)激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進卵巢癌細胞增殖[16]。另外有研究顯示[17]，當(dāng)ZNF217出現(xiàn)異常高表達后，可在一定程度上促進腫瘤細胞異常增殖和遷移，促進疾病進一步進展、惡化。本研究結(jié)果顯示，ZNF217在膀胱癌組織中高表達，且與患者分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、復(fù)發(fā)情況相關(guān)，此結(jié)果提示PZNF217異常高表達與疾病進展相關(guān)，在此病的演進過程中具有重要的意義。

細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和活動與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，在此過程中細胞表面的膜受體具有重要的意義，G蛋白偶聯(lián)受體屬于一種最大的膜蛋白家族，其具有7個跨膜結(jié)構(gòu)，可經(jīng)過與多種膜信號分子的特異性結(jié)合作用參與免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生發(fā)展、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定調(diào)節(jié)、行為、情緒控制等多種生理病理過程[18-19]。臨床上將G蛋白偶聯(lián)受體分為A、B、C型三種，其中GPR48屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族超家族的A10亞型，其位于激素結(jié)合區(qū)域，在多種組織器官發(fā)育中具有重要的意義[20]。研究顯示[21-22]，GPR48其異常表達參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，其失活可誘發(fā)先天性AGR綜合征的發(fā)生，其基因突變可增加膽道扁平細胞癌、皮膚癌的發(fā)病率，可經(jīng)作用于Jmjd2a/AR信號通路誘導(dǎo)前列腺癌的發(fā)生。目前臨床上對于GPR48與膀胱癌的關(guān)系研究較少，僅有季德才等[23]、王俊勇等[24]認為GPR48基因在膀胱癌組織中異常高表達?；谏鲜鲅芯勘尘?，本文分析GPR48與膀胱癌演進的關(guān)系，結(jié)果顯示，GPR48在膀胱癌組織中高表達，且與患者分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、復(fù)發(fā)情況相關(guān)，此結(jié)果提示GPR48異常高表達與疾病進展相關(guān)，在此病的演進過程中具有重要的意義。

另外本研究還對PAK6、ZNF217、GPR48三者之間相關(guān)性進行分析，結(jié)果顯示，PAK6與ZNF217、GPR48均負相關(guān)，ZNF217、GPR48之間正相關(guān)，提示著三者可能共同參與膀胱癌的發(fā)展過程，但目前臨床上對于三者與膀胱癌演進的關(guān)系研究較少，且本研究所選取的樣本量較少，因此本研究結(jié)果還需后續(xù)研究進一步證實，以期望為臨床上膀胱癌的診治提供研究新方向。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PAK6在膀胱癌組織中低表達，ZNF217、GPR48在膀胱癌組織中高表達，與患者分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、復(fù)發(fā)相關(guān)，參與膀胱癌的演進。