唐旭， 陳健， 謝凱△

1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院康復(fù)科(浙江寧波 315020)； 2寧波市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子診斷中心(浙江寧波 315020)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis, OP)是一種好發(fā)于老年人的代謝性骨病，易引發(fā)骨折，引起肢體畸形，使患者活動(dòng)受限，對(duì)患者正常生活構(gòu)成不良影響[1-2]。積極尋找與OP發(fā)病相關(guān)因素，給予適當(dāng)干預(yù)，甚是重要。目前，研究認(rèn)為，OP病理變化與微小RNA(microRNA, miRNA)異常表達(dá)、骨代謝異常、炎癥反應(yīng)、激素異常分泌等相關(guān)[3-4]。研究顯示，微小RNA-155-5p(microRNA-155-5p, miR-155-5p)可調(diào)控破骨細(xì)胞分化[5]；另外，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)是IL-1家族重要成員，主要由巨噬細(xì)胞分泌，其可通過旁分泌、自分泌等方式參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)，而腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)是一種Ⅱ型膜蛋白，其作為重要的炎癥反應(yīng)因子，其可參與原發(fā)性炎癥反應(yīng)，也可影響繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，與免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)毒素休克、腫瘤發(fā)展等有關(guān)，IL-1β、TNF-α均在老年OP患者中呈高水平，兩者均可能參與OP發(fā)生，測(cè)定血清IL-1β、TNF-α水平有助于臨床診治OP，評(píng)估患者預(yù)后[6]。推測(cè)miR-155-5p可能與OP發(fā)病相關(guān)?；诖?，本研究通過測(cè)定miR-155-5p在老年OP患者中的表達(dá)水平，分析其與IL-1β、TNF-α及骨代謝指標(biāo)的關(guān)系，為臨床診治老年OP提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年8月至2021年1月本院診治的老年OP患者90例為OP組，其中男39例，女51例，年齡61～82歲，平均(70.83±7.78)歲，體質(zhì)指數(shù)(body mass index, BMI)17.14～24.80 kg/m2，平均(21.24±2.31)kg/m2；吸煙46例。另納入同期老年體檢健康者90例為健康組，其中男44例，女46例，年齡61～82歲，平均(71.02±7.91)歲，BMI為17.06～24.89 kg/m2，平均(21.33±2.35)kg/m2，無嚴(yán)重心、肝、腎、肺等臟器疾病，無OP疾病，近期無炎性疾??；吸煙40例。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

OP診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《中國人骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)專家共識(shí)》[7]OP相關(guān)判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者年齡>60歲，均符合OP診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)臨床資料完整；(3)可清晰溝通交流、無認(rèn)知障礙。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并結(jié)締組織疾病、糖尿病、代謝營養(yǎng)性骨病者；(2)合并心血管系統(tǒng)疾病、肝腎功能不全、甲狀腺功能亢進(jìn)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎者；(3)合并骨腫瘤或其他腫瘤者；(4)近6個(gè)月內(nèi)使用維生素D、鈣劑、糖皮質(zhì)激素者。

本研究符合《赫爾辛基宣言》，經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲取受試對(duì)象本人或其親屬知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 收集體檢健康者及老年OP患者空腹外周血，靜置后分離血清(4 600 r/min離心5 min)，分裝，于-70℃冰箱保存，備用。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)法檢測(cè)血清miR-155-5p表達(dá)水平 冰上解凍適量血清，加cel-miR-39以校正血清miR-155-5p水平，利用miRNA純化試劑盒(貨號(hào)：FuHengT009，上海富衡生物科技有限公司)純化miRNA，依據(jù)TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit(貨號(hào)：4366597，ThermoFisher)說明書獲取cDNA，最終，應(yīng)用TaqManTMUniversal PCR Master Mix(貨號(hào)：AB-4324018，美國Invitrogen)制備反應(yīng)體系，加樣，在熒光定量PCR儀(型號(hào)：StepOneTM，美國ABI)上檢測(cè)。反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性25 s，65℃退火30 s、70℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)3次。其中cel-miR-39引物序列為5′-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3′，miR-155-5p上游引物序列為5′-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3′，下游引物序列為5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。以2-ΔCt法計(jì)算血清miR-155-5p水平，ΔCt=目的基因Ct值-cel-miR-39 Ct值。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)測(cè)定血清IL-1β、TNF-α水平 于-20℃冰箱中取出人IL-1β ELISA試劑盒(貨號(hào)：111010，廣州蕊特生物科技有限公司)、人TNF-α ELISA試劑盒(貨號(hào)：ABE10038，上海瓦蘭生物科技有限公司)所攜帶的標(biāo)準(zhǔn)品，按其說明書將標(biāo)準(zhǔn)品制成不同濃度的IL-1β、TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于波長450 nm處使用酶標(biāo)儀(型號(hào)：MultiskanFC，賽默飛世爾)測(cè)定IL-1β、TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度，繪制兩者的標(biāo)準(zhǔn)品回歸曲線；將-70℃冰箱中凍存的血清樣本取出，室溫下解凍，平衡至室溫約30 min，將血清加至96孔酶標(biāo)板中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔100 μL血清；將酶標(biāo)板置于37℃培養(yǎng)箱中，孵育25～30 min，每孔分別加含有IL-1β/TNF-α的生物素工作液，再次將酶標(biāo)板放入37℃培養(yǎng)箱中，孵育50～60 min，棄反應(yīng)液后用磷酸緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)洗2～3次；每孔加100 μL親和素-過氧化物酶復(fù)合物工作液后，酶標(biāo)板放于37℃培養(yǎng)箱中，恒溫孵育25～30 min，棄反應(yīng)液后用PBS洗2次；每孔加90 μL顯色液，37℃培養(yǎng)箱中孵育約25 min，每孔均加10 μL終止液，于波長450 nm處讀取血清樣本吸光度，結(jié)合IL-1β、TNF-α的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，計(jì)算兩者血清水平。

1.2.4 血清Ⅰ型前膠原氨基端前肽(procollagen Ⅰ type N-terminal peptide, PINP)、β-膠原特殊序列(β-CrossLaps)水平檢測(cè) 室溫解凍血清，應(yīng)用全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(cobas 6000e601，羅氏公司)及配套試劑盒測(cè)定血清PINP、β-CrossLaps水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平比較 與健康組相比，OP組患者血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平比較

2.2 兩組血清PINP、β-CrossLaps水平比較 與健康組相比，OP組患者血清PINP降低(P<0.05)，β-CrossLaps水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血清PINP、β-CrossLaps水平比較

2.3 老年OP患者血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平與PINP、β-CrossLaps水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，老年OP患者血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平與PINP水平均呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)，與β-CrossLaps水平呈正相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 老年OP患者血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平與PINP、β-CrossLaps水平的相關(guān)性

2.4 老年OP患者血清miR-155-5p表達(dá)水平與IL-1β、TNF-α水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，老年OP患者血清miR-155-5p表達(dá)水平與IL-1β、TNF-α水平均呈正相關(guān)(r=0.596、0.565，P均<0.05)。見圖1、2。

圖1 老年OP患者血清miR-155-5p表達(dá)水平與IL-1β水平的相關(guān)性

圖2 老年OP患者血清miR-155-5p表達(dá)水平與TNF-α水平的相關(guān)性

2.5 Logistic回歸分析影響老年OP發(fā)生的影響因素 以miR-155-5p、IL-1β、TNF-α、PINP、β-CrossLaps為自變量。以老年OP是否發(fā)生(發(fā)生=1、不發(fā)生=0)為因變量，將賦值后的miR-155-5p、IL-1β、TNF-α、PINP、β-CrossLaps納入logistic回歸分析，結(jié)果顯示miR-155-5p、IL-1β、TNF-α、β-CrossLaps均是影響老年OP發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，PINP是影響老年OP發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響老年OP發(fā)生的logistic回歸分析

3 討論

骨成熟后，骨組織處于成骨細(xì)胞形成新骨與破骨細(xì)胞對(duì)舊骨吸收的平衡中，任何造成骨形成低于骨吸收的因素均可引起骨量減少、OP的發(fā)生[8-9]。因老年人整體功能低下，更易導(dǎo)致骨形成低于骨吸收，進(jìn)而引發(fā)OP[10-11]。近年來，隨著人口老齡化日趨嚴(yán)重，OP發(fā)生率逐年升高，其易造成骨折，嚴(yán)重影響老年OP患者生活質(zhì)量，因此，尋找與OP發(fā)病相關(guān)的指標(biāo)，及時(shí)干預(yù)，對(duì)改善老年OP患者生存質(zhì)量有積極意義。

miRNA是存在于血清、血漿、組織液中的一類小RNA分子，其在氧化應(yīng)激、機(jī)體代謝、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控作用，與骨關(guān)節(jié)炎、OP、骨質(zhì)增生等疾病進(jìn)展關(guān)系密切[12-15]。既往研究顯示，miR-155是miRNA的一員，其可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等過程，而miR-155-5p作為miR-155的重要成員，其在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中呈高表達(dá)，miR-155-5p可能通過影響NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而影響軟骨細(xì)胞凋亡、增殖[16]；另外，miR-155-5p下調(diào)可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞侵襲及生長，其可作為診治類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在指標(biāo)[17-18]。以上研究表明，miR-155-5p可能與骨代謝異常疾病有關(guān)。本研究中老年OP患者血清miR-155-5p表達(dá)水平高于健康者，提示miR-155-5p可能在老年OP中起作用，推測(cè)miR-155-5p高表達(dá)可能激活NF-κB信號(hào)通路，影響其下游基因表達(dá)及骨細(xì)胞生長，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響OP發(fā)生發(fā)展。NF-κB參與炎癥反應(yīng)、成骨細(xì)胞凋亡、分化、增殖過程，影響骨形成與骨吸收，與OP密切相關(guān)[19-20]。

IL-1β、TNF-α是NF-κB信號(hào)通路的下游基因，兩者在OP患者中水平較高，與骨密度相關(guān)，經(jīng)二磷酸鹽治療后，其水平降低，IL-1β、TNF-α可能在OP病變過程中起作用[21]。本研究顯示，OP組患者血清IL-1β、TNF-α水平高于健康組，與陳楊暢等[6]研究結(jié)果相符，提示OP發(fā)生發(fā)展可能與IL-1β、TNF-α水平異常有關(guān)，分析原因，IL-1β高水平可降低骨細(xì)胞活性，減少骨形成，降低骨密度，影響OP病理發(fā)展；TNF-α可促進(jìn)骨吸收，阻斷骨基質(zhì)膠原合成，且其可直接損傷腎血管-基底膜屏障，使血管通透性增高，造成血清蛋白滲漏，打破鈣磷代謝平衡，進(jìn)而引發(fā)OP[6]。此外，本研究中老年OP患者血清miR-155-5p表達(dá)水平與IL-1β、TNF-α水平均呈正相關(guān)，提示miR-155-5p可能通過影響NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)IL-1β、TNF-α表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，從而在老年OP中發(fā)揮作用，但具體機(jī)制仍需深入探究證實(shí)。

骨代謝標(biāo)志物水平可靈敏地反映機(jī)體骨骼狀態(tài)，有助于判定機(jī)體是否存在OP。其中，PINP可反映Ⅰ型膠原水平，其水平升高表示Ⅰ型膠原合成速度加快，骨代謝轉(zhuǎn)換活躍，PINP是骨形成的重要指標(biāo)；而β-CrossLaps是源于骨質(zhì)中的膠原成分，可作為骨吸收的有效標(biāo)志物，PINP、β-CrossLaps水平變化可靈敏地反映機(jī)體骨代謝水平[22-25]。研究發(fā)現(xiàn)，PINP在老年原發(fā)性O(shè)P中水平較低，經(jīng)強(qiáng)骨膠囊與鹿瓜多肽注射液聯(lián)合治療后，PINP水平升高，其可能是判斷老年原發(fā)性O(shè)P治療效果的指標(biāo)[26]；另外，β-CrossLaps在老年原發(fā)性O(shè)P中水平升高，其可輔助診治老年原發(fā)性O(shè)P[27]。以上研究表明，PINP、β-CrossLaps水平異?？赡芘cOP相關(guān)。本研究顯示，OP組患者血清PINP水平低于健康組，β-CrossLaps水平高于健康組，與相關(guān)研究[21-22]趨勢(shì)一致，且老年OP患者血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α水平與PINP水平均呈負(fù)相關(guān)，與β-CrossLaps水平呈正相關(guān)，提示老年OP患者存在骨代謝異常，且miR-155-5p、IL-1β、TNF-α可能通過影響骨代謝進(jìn)而影響OP發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步研究顯示，miR-155-5p、IL-1β、TNF-α、β-CrossLaps均是影響老年OP發(fā)生的危險(xiǎn)因素，PINP是影響老年OP發(fā)生的保護(hù)因素，提示血清miR-155-5p、IL-1β、TNF-α、β-CrossLaps水平越高，PINP水平越低，骨代謝失衡越嚴(yán)重，及時(shí)監(jiān)測(cè)上述指標(biāo)，有利于臨床及早診治老年OP。

綜上所述，miR-155-5p在老年OP患者中呈高表達(dá)，其與IL-1β、TNF-α及骨代謝關(guān)系密切，監(jiān)控miR-155-5p水平可能有助于臨床防治老年OP。本研究首次從臨床方面確定miR-155-5p在老年OP患者中表達(dá)失調(diào)，并分析了其與IL-1β、TNF-α及骨代謝指標(biāo)的相關(guān)性，為臨床診治老年OP提供新思路，但后期仍需進(jìn)一步探究miR-155-5p在老年OP中的作用機(jī)制，為臨床診治老年OP增加說服力。