劉超 王文靜 （中國(guó)人民解放軍陸軍第八十集團(tuán)軍醫(yī)院,山東 淮坊 261000）

絕經(jīng)后的女性，由于吸收速度大于骨的形成速度，兩者處于不平衡狀態(tài)，易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松（OP）〔1〕。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）是傳遞重要信號(hào)的使者〔2〕。絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）是可調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、增殖等功能的一種原癌基因〔3〕。Smad7 是一種參與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β 超家族細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制蛋白，其參與了細(xì)胞凋亡、免疫性疾病等病理生理進(jìn)程〔4〕。表達(dá)異常的Smad7 蛋白通常會(huì)給機(jī)體帶來疾病，在去勢(shì)OP 模型大鼠成骨細(xì)胞中，下調(diào)Smad7 可促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化〔5〕。本文旨在研究基于PI3K/Akt 通路下調(diào)Smad7對(duì)去勢(shì)OP 大鼠的干預(yù)效果。

1 材料與方法

1.1 材料 40 只清潔級(jí)健康SD 雌性大鼠，鼠齡6～8 w，體重為220～260 g，均購自中山大學(xué)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心東校區(qū)），生產(chǎn)許可:SCXK（粵）2016-0029。大鼠分籠飼養(yǎng)，均在無約束進(jìn)食及飲水環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 OP 模型建立 從40 只大鼠中任意選取10 只為正常組，其余30 只參考胡倩倩等〔6〕OP 模型，具體操作:對(duì)大鼠進(jìn)行6 h 的禁食，麻醉前將大鼠耳朵、尾部、脖頸部位固定，經(jīng)大鼠腹腔使用0.3 ml/100 g戊巴比妥鈉（上海信裕生物科技有限公司）進(jìn)行注射麻醉，注射10 min 后將大鼠以仰臥位固定在鼠板上，將大鼠的背部試驗(yàn)區(qū)部位除毛，再用酒精（今勝化工有限公司）進(jìn)行充分消毒，使用經(jīng)過高溫消毒的醫(yī)用剪刀切開雙側(cè)第3 腰推背側(cè)正中皮膚，按照順序?qū)⒓∪?、筋膜分離，將卵巢暴露出來，從輸卵管端將其結(jié)扎，將殘余組織歸納完腹腔后縫合切口，建立OP 模型，大鼠均全部建模成功。

1.3 大鼠Smad7 基因的干預(yù)及分組 Smad7 的siRNA，5＇-AACGAUCUGCGCUCGUCCGGCGUDTDT-3＇為正義鏈；3＇-DTDTUUGCUAGACGCGAGCAGGCCGCA-5＇為反義鏈。將所購買的Smad7 模擬物（Smad7 mimic，上調(diào)）、Smad7 抑制物（Smad7 inhibitor，下調(diào)）利用Lippofectamine 2000 試劑盒稀釋為5 mmol/L，將稀釋后的Smad7 模擬物、Smad7 抑制物分別注射于上調(diào)組、下調(diào)組大鼠胃組織中，空白組、模型組注射同劑量的蒸餾水灌胃，注射24 h 后觀察大鼠變化。轉(zhuǎn)染的前1 d，用不含血清和抗生素的高糖DMEM 代替培養(yǎng)液，待24 孔板內(nèi)細(xì)胞融合至80%時(shí)，分別將Smad7 基因的siRNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每只大鼠0.5 ml 腹腔注射磷酸緩沖鹽溶液，均注射一次，14 d 后，對(duì)照磷酸緩沖鹽溶液及陰性siRNA，將建模大鼠隨機(jī)分為即去勢(shì)OP 組、上調(diào)組和下調(diào)組，正常組也給予等體積磷酸緩沖鹽溶液干預(yù)。轉(zhuǎn)染的濃度為50 nmol/L，待1 d 后進(jìn)行糖氧剝奪（OGD）16 h。

1.4 Smad7 基因檢測(cè) 采用熒光定量PCR 檢測(cè)Smad7，用Trizol 的方法，提取所收集的細(xì)胞內(nèi)總RNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA。使用熒光定量PCR 儀（雅睿生物科技有限公司）檢測(cè)Smad7基因及內(nèi)參GAPDH mRNA 表達(dá)，檢測(cè)試驗(yàn)共重復(fù)3次，采用軟件Relative Quantification Study 定量分析。共干預(yù)12 w。

1.5 病理學(xué)觀察 股骨頭蘇木素-伊紅（HE）染色步驟:①固定大鼠的股骨頭于4%多聚甲醛溶液中。②取出固定的組織，使用手術(shù)刀將其切成厚度10 μm的樣品。③將樣品經(jīng)乙醇梯度脫蠟至水，隨后放入Harris 蘇木素染4～10 min，用純凈水清洗。④迅速用1% 的鹽酸乙醇進(jìn)行分色，置于純凈水10～20 min。⑤放入伊紅染液中染色3 min。⑥常規(guī)脫水后封片，于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.6 各組大鼠血清中鈣、磷、堿性磷酸酶（ALP）水平及股骨頭中骨密度（BMD）、骨鈣素（OCN）、Ⅰ型前膠原氨基末端肽（PINP）水平比較 使用戊巴比妥鈉進(jìn)行注射麻醉，取腹主動(dòng)脈血2 ml，置于轉(zhuǎn)速為3 000 r/min 離心機(jī)中進(jìn)行10 min 的離心處理。分離上血清，置于-80℃的環(huán)境中保存血清標(biāo)本。采用全自動(dòng)生化儀（海聚慕醫(yī)療，批準(zhǔn)文號(hào):豫械注準(zhǔn)20182400088）檢測(cè)鈣、磷、ALP 水平:設(shè)置反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、主波長(zhǎng)分別為37℃、8 min、600 nm，使用蒸餾水在實(shí)驗(yàn)前為空白和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定標(biāo)。將標(biāo)準(zhǔn)液稀釋為1 000 mg/L、600 mg/L、200 mg/L 3 個(gè)濃度，各檢測(cè)2 次取平均值。BMD、OCN、PINP 水平檢測(cè):采用雙能X 線骨密度儀（圣迅醫(yī)療器械有限公司）測(cè)定BMD、OCN、PINP 水平，以仰臥位將大鼠固定在鼠板上，用70 和130 kV 開關(guān)脈沖穩(wěn)定的雙輻射能量串行掃描大鼠股骨頭，分析掃描圖像得出BMD、OCN、PINP 水平。

1.7 各組大鼠股骨頭中磷酸化（p）-PI3K、p-Akt 蛋白水平比較 應(yīng)用免疫蛋白印跡（WB）法測(cè)定。使用RIPA 緩沖液提取總細(xì)胞裂解物，配置含量12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE，恒壓80 V，2 h），將蛋白質(zhì)分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，密封于5%脫脂奶粉中，并在4℃下與一抗孵育過夜。用緩沖液洗膜并作用15 min，重復(fù)3次。將膜與二抗孵育，于5℃中作用120 min，隨后涂上發(fā)光劑，曝光并掃描。采用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。參照蛋白為β-actin。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行齊性方差、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Smad7 基因表達(dá)比較 與正常組（0.079±0.008）相比，去勢(shì)OP 組（0.210±0.012）、上調(diào)組（0.193±0.011）、下調(diào)組（0.097±0.013）Smad7 基因表達(dá)升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與去勢(shì)OP 組相比，上調(diào)組、下調(diào)組Smad7 基因表達(dá)降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與上調(diào)組相比，下調(diào)組Smad7 基因表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

2.2 各組股骨頭HE 染色觀察 如圖1 所示，正常組骨小梁間隙較大，骨小梁組織幾乎無損害；去勢(shì)OP 組骨小梁間隙小，結(jié)構(gòu)不清晰，且骨小梁吸收慢或不吸收；上調(diào)組相較于去勢(shì)OP 組骨小梁間隙有所增大，骨小梁吸收變快但不明顯；下調(diào)組細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核顏色分明，骨小梁吸收程度較快，有骨密度升高的表現(xiàn)。

圖1 各組股骨頭HE 染色觀察(×200)

2.3 各組BMD、鈣、磷水平比較 見表1。與正常組相比，去勢(shì)OP 組、上調(diào)組、下調(diào)組BMD、鈣、磷水平均降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與去勢(shì)OP組相比，上調(diào)組、下調(diào)組BMD、鈣、磷水平均升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與上調(diào)組相比，下調(diào)組BMD、鈣、磷水平均明顯升高（P＜0.05）。

2.4 各組ALP、OCN、PINP 水平比較 與正常組相比，去勢(shì)OP 組、上調(diào)組、下調(diào)組ALP、OCN、PINP 水平均明顯升高（P＜0.05）。與去勢(shì)OP 組相比，上調(diào)組、下調(diào)組ALP、OCN、PINP 水平均明顯降低（P＜0.05）。與上調(diào)組相比，下調(diào)組ALP、OCN、PINP 水平均明顯降低（P＜0.05）。見表1。

2.5 各組p-PI3K、p-Akt 蛋白水平比較 與正常組相比，去勢(shì)OP 組、上調(diào)組、下調(diào)組p-PI3K、p-Akt 蛋白水平均升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與去勢(shì)OP 組相比，上調(diào)組、下調(diào)組p-PI3K、p-Akt 蛋白水平均降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與上調(diào)組相比，下調(diào)組p-PI3K、p-Akt 蛋白水平均明顯降低（P＜0.05）。見表1、圖2。

表1 各組BMD、鈣、磷、ALP、OCN、PINP、p-PI3K、p-Akt 水平比較(,n=10)

表1 各組BMD、鈣、磷、ALP、OCN、PINP、p-PI3K、p-Akt 水平比較(,n=10)

與正常組相比:1）P＜0.05；與去勢(shì)OP 組相比:2）P＜0.05；與上調(diào)組相比:3）P＜0.05

圖2 各組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)

3 討論

OP 是一種以低骨量、骨骼微結(jié)構(gòu)破損而出現(xiàn)的一種全身性骨病，其對(duì)骨骼的危害巨大，其致殘和致死是老年患者的主要原因之一〔7〕。目前影響OP 的因素較多，一部分人認(rèn)為形態(tài)上的因素（形狀、物體受力等）、不正確的生活方式、影響骨代謝的藥物及疾病等可影響骨的形成和骨吸收，而大部分研究表明，OP 與遺傳、雌激素、營(yíng)養(yǎng)情況有關(guān)〔8〕。絕經(jīng)后OP 女性由于卵巢功能衰退、雌激素水平降低而減弱對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用，導(dǎo)致吸收速度大于骨的形成速度，使骨量降低且骨骼呈現(xiàn)細(xì)微結(jié)構(gòu)破壞，而容易致使骨折〔9〕。在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）/Smad 蛋白活動(dòng)信號(hào)通路中，Smad7 是其重要的成員，可抑制、調(diào)節(jié)多種細(xì)胞進(jìn)程。鄧純博等〔10〕指出，Smad7 可以調(diào)節(jié)破骨和成骨細(xì)胞，介入骨骼重塑，而Smad7 本身也可調(diào)節(jié)絕經(jīng)后OP。BMD 是表示骨骼強(qiáng)度的一個(gè)首要指標(biāo)，其反映OP 水平，預(yù)判骨折的危險(xiǎn)性〔11〕。鈣是一種銀白色的金屬元素，在骨骼中，鈣是以晶體的形式存在，占體重的2%。鈣作為生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的無機(jī)鹽，可擴(kuò)張細(xì)胞的通透性、促進(jìn)骨骼、牙齒的發(fā)育〔12〕。隨著年齡增長(zhǎng)，女性絕經(jīng)后體內(nèi)的鈣營(yíng)養(yǎng)被大量消耗、BMD 下降而導(dǎo)致OP〔13〕。在人體所有細(xì)胞中，都有磷的存在，幾乎所有生理上的化學(xué)反應(yīng)都有磷的參與，它是骨骼的構(gòu)成中不可或缺的材料，可調(diào)節(jié)體內(nèi)酸堿平衡、參與人體代謝，而它的作用和活動(dòng)能力需要維生素D 和鈣來維持〔14〕。本文研究中，下調(diào)Smad7 可促進(jìn)BMD、鈣、磷水平，進(jìn)而提高去勢(shì)OP 模型大鼠骨骼強(qiáng)度。

ALP 是一種經(jīng)肝臟向膽外排出的糖蛋白，廣泛分布于骨骼、肝臟等組織內(nèi)，是反映骨變的重要指標(biāo)〔15〕。OCN 是一種維生素K 依賴性鈣結(jié)合的蛋白質(zhì)，在骨組織內(nèi)，其是非膠原蛋白主要成分。OCN在骨鈣代謝的調(diào)節(jié)中有著重要用途，由成牙質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞等合成，反映了骨代謝的總體水平〔16〕。在骨代謝指標(biāo)中，PINP 可評(píng)價(jià)骨量、預(yù)測(cè)OP 的出現(xiàn)，且有較高的特異性和敏感性〔17〕。Akt 是一種含有480 個(gè)氨基酸殘基的蛋白激酶，可保護(hù)細(xì)胞使其不受凋亡的影響〔18〕。PI3K 在膜轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)傳導(dǎo)及代謝的過程中有著重要作用，可調(diào)節(jié)癌癥、機(jī)體衰老、生物學(xué)細(xì)胞、組織〔19，20〕。PI3K 通過磷酸化Akt 激活增強(qiáng)雷帕霉素靶體蛋白，使腫瘤抑制基因生成磷脂酰肌醇2 磷酸，進(jìn)而傳遞細(xì)胞的分化、增殖和遷移〔21〕。本研究結(jié)果提示下調(diào)Smad7 可改善去勢(shì)OP模型大鼠骨代謝。綜上所述，通過下調(diào)Smad7 可提高去勢(shì)OP 模型大鼠BMD、鈣、磷水平，降低去勢(shì)OP模型大鼠ALP、OCN、PINP、p-PI3K、p-Akt 水平，增強(qiáng)大鼠骨骼強(qiáng)度，調(diào)控骨代謝，其作用機(jī)制可能與PI3K/Akt 蛋白有關(guān)，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。