李相華 譚雙 劉春芹 李永秋 （唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 唐山 063000）

血管性癡呆（VD）是一種由腦血管病變引起的腦組織損傷，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的疾病，主要表現(xiàn)為記憶、認(rèn)知、思維等功能減退〔1〕。我國60 歲以上的人群VD 發(fā)病率為1.3%～2.4%，是僅次于阿爾茨海默病的第二大癡呆類疾病〔2〕。姜黃素是姜黃根莖的主要成分，有抗菌、抗炎、抗氧化等作用，對阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病有保護(hù)神經(jīng)的作用〔3〕。本研究分析姜黃素對VD 大鼠認(rèn)知和記憶功能障礙及海馬神經(jīng)再生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與藥品 雄性健康SD 大鼠30 只，8 周齡，體重220～250 g，許可證號:SYXK（冀）2019-011，購自華北制藥股份有限公司。姜黃素購自廣州龍德生物科技有限公司，純度 99%，批號:19050302，生產(chǎn)批號:SC20141011000026。

1.1.2 試劑與儀器 Morris 水迷宮購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所；蛋白提取試劑盒購自北京普利萊公司；腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）抗體、酪氨酸蛋白激酶受體（Trk）B 抗體均購自北京義翹神州科技股份有限公司；JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Cleaved Caspase-3、Ki-67抗體購自美國Abcam。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 按照參考文獻(xiàn)〔4〕方法，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組各10 只。4%水合氯醛1 ml/10 g 腹腔注射麻醉大鼠，完全暴露大鼠頸部皮膚，沿皮膚中線切開約1.5 cm切口，將右側(cè)頸總動脈與迷走神經(jīng)分開后進(jìn)行分段結(jié)扎，結(jié)扎后剪斷頸總動脈，尾頸總動脈不做處理。假手術(shù)組不做結(jié)扎與切斷頸總動脈。

1.2.2 評定造模成功的標(biāo)準(zhǔn) 按照參考文獻(xiàn)〔5〕方法，造模約1 w 后，待大鼠頸部傷口愈合，對大鼠進(jìn)行Morris 水迷宮行為學(xué)測評，以假手術(shù)組逃避潛伏期為參考值，計(jì)算各組逃避潛伏期與參考值之差，若比值＞20%，則評定為有認(rèn)知功能障礙的大鼠，即造模成功。

1.2.3 給藥方法 造模評定成功后開始給藥，實(shí)驗(yàn)組給予姜黃素300 mg/kg 灌胃，1 次/d，持續(xù)4 w。假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.2.4 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 按照參考文獻(xiàn)〔6〕方法，各組大鼠在造模成功28 d 后進(jìn)行Morris 水迷宮，連續(xù)5 d，2 次/d。大鼠頭朝向池壁從4 個(gè)不同的象限中點(diǎn)放入水中，讓大鼠在水中自由游動，如果大鼠能在2 min 內(nèi)爬上平臺，則讓大鼠在平臺上停留30 s，幫助大鼠強(qiáng)化記憶；如果大鼠不能尋找到平臺，則由實(shí)驗(yàn)者引導(dǎo)大鼠至平臺，然后讓大鼠在平臺上停留30 s。大鼠實(shí)際尋找平臺的時(shí)間為逃避潛伏期。在水池正上方設(shè)有攝像系統(tǒng)記錄大鼠從不同入水點(diǎn)爬上站臺消耗的時(shí)間為逃避潛伏期，取當(dāng)日訓(xùn)練逃避潛伏期的平均值為當(dāng)日逃避潛伏期?？臻g探索試驗(yàn):訓(xùn)練5 d 結(jié)束后拆去平臺，將大鼠從原平臺所在象限的對側(cè)象限中點(diǎn)頭朝向池壁放入水中，記錄大鼠2 min 內(nèi)穿越原有平臺位置的次數(shù)和游動的速度。

1.2.5 Western 印跡檢測蛋白的表達(dá) 按照參考文獻(xiàn)〔7〕方法，取大鼠右側(cè)海馬組織加入裂解液，充分裂解后離心30 min，取上清液。1 ∶4加入蛋白緩沖液，煮沸變性10 min。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，轉(zhuǎn)膜，漂洗5 min，5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，分別加入相應(yīng)的一抗4℃孵育過夜。次日采用Tris 鹽酸緩沖鹽溶液加吐溫（TBST）漂洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影，保存圖像。運(yùn)用Image J 軟件分析X 光片中條帶的灰度值，BDNF、Cleaved Caspase-3、Ki-67、TrkB 表達(dá)水平用灰度值表示，內(nèi)參為β-actin。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率 按照參考文獻(xiàn)〔8〕方法，將大鼠斷頭后用75%乙醇消毒5 min，在冰盤上快速分離取出海馬，剪碎海馬組織輕輕研磨，經(jīng)300 目篩網(wǎng)過濾，配制細(xì)胞懸液，以4 000 r/min離心3 min，去掉上清液，加入JC-1 工作液，37℃避光孵育20 min，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7 細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測（CCK）-8 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 按照1.2.6 中方法收集細(xì)胞，接種到96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后，在每個(gè)孔內(nèi)添加CCK-8 溶液10 μl，放在37℃孵育4 h。用酶標(biāo)儀檢測450 nm 的OD 值。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD 值/對照組OD 值×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)變化 與假手術(shù)組相比，模型組逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺的次數(shù)和游動速度明顯降低（均P＜0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組逃避潛伏期顯著縮短，穿越平臺的次數(shù)和游動速度顯著增加（均P＜0.05）。見表1。

表1 各組逃避潛伏期及穿越原有平臺位置的次數(shù)和游動速度(,n=10)

表1 各組逃避潛伏期及穿越原有平臺位置的次數(shù)和游動速度(,n=10)

與假手術(shù)組比較:1）P＜0.05；與模型組比較:2）P＜0.05；表2 同

2.2 海馬中BDNF、TrkB 蛋白表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組BDNF 和TrkB 蛋白的表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組BDNF、TrkB 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。見表2 和圖1。

圖1 各組BDNF、TrkB 蛋白表達(dá)條帶

表2 3 組海馬BDNF、TrkB 蛋白表達(dá)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、存活及Ki-67、Cleaved Caspase-3 表達(dá)(,n=10)

表2 3 組海馬BDNF、TrkB 蛋白表達(dá)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、存活及Ki-67、Cleaved Caspase-3 表達(dá)(,n=10)

2.3 海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率 與假手術(shù)組相比，模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和凋亡蛋白 Cleaved Caspase-3 表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞存活率和增殖蛋白Ki-67 表達(dá)量顯著降低（均P＜0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和凋亡蛋白Cleaved Caspase-3 表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞存活率和增殖蛋白Ki-67 表達(dá)量顯著升高（均P＜0.05）。說明姜黃素可減少海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。見表2。

3 討論

VD 占所有癡呆病例的15%～20%，有研究表明〔9〕，海馬的膽堿能神經(jīng)元對學(xué)習(xí)和記憶功能有重要影響。BDNF 主要分布在大腦皮質(zhì)、脊髓及海馬，BDNF 不僅與神經(jīng)元的生長及存活有關(guān)，而且可調(diào)節(jié)突觸傳傳遞和可塑性，與學(xué)習(xí)記憶功能有密切關(guān)聯(lián)。BDNF 表達(dá)增加是神經(jīng)元反應(yīng)性的自我保護(hù)，通過與受體TrkB 或p75NTR 結(jié)合，能維持神經(jīng)元存活、減輕神經(jīng)元損傷〔10〕。BDNF 對于運(yùn)動神經(jīng)、中樞及外周神經(jīng)而言是一個(gè)有效的生長因子，BDNF對神經(jīng)元的存活有關(guān)鍵作用，其可作為信號通路的配體與TrkB 結(jié)合，以激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路來促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育、分化和再生〔11〕。研究表明〔12〕，BDNF 與海馬神經(jīng)發(fā)生和海馬細(xì)胞增殖有關(guān)，海馬長時(shí)程增強(qiáng)作用是由BDNF/TrkB 信號傳遞誘導(dǎo)的。有研究報(bào)道〔13〕，姜黃素能在缺血性腦卒中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示BDNF 基因可促進(jìn)海馬細(xì)胞增殖，并延長細(xì)胞存活時(shí)間，這可能是姜黃素促進(jìn)細(xì)胞再生的原因。

綜上，姜黃素能改善VD 大鼠認(rèn)知和記憶功能障礙，通過提高BDNF 和TrkB 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞再生，具有防治VD 的作用。