楊莉，侯軍良，馮愛東，劉騰飛，許怡

石家莊市第五醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊 050021

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行，全球感染人數(shù)約有2.57億人，其中約有88.7萬人死于相關(guān)疾?。?］。核苷（酸）類似物（NAs）通過抑制HBV聚合酶活性達(dá)到強(qiáng)效的抑制病毒復(fù)制作用，有用法方便及不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，是慢性乙型肝炎（CHB）患者優(yōu)先選擇的治療方案，但長期、廣泛應(yīng)用會誘發(fā)HBV多聚酶基因逆轉(zhuǎn)錄保守區(qū)（P區(qū)）位點(diǎn)突變，使HBV對該類NAs出現(xiàn)耐藥，導(dǎo)致病情反彈［2-4］。CHB是一種免疫相關(guān)性疾病，HBV通過誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)間接地?fù)p傷肝細(xì)胞。CHB患者的機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能紊亂導(dǎo)致CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞顯著降低，所以T淋巴細(xì)胞亞群是治療CHB時(shí)人們常關(guān)注的指標(biāo)［5-6］。那么CHB患者體內(nèi)HBV發(fā)生耐藥基因突變時(shí)，T淋巴細(xì)胞亞群的狀態(tài)是怎樣的，有那些因素影響T淋巴細(xì)胞亞群的功能，這方面的研究目前較少。本研究通過觀察CHB患者經(jīng)NAs治療發(fā)生病毒P區(qū)耐藥基因突變后，患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群變化，探討HBV發(fā)生P區(qū)耐藥基因突變后對慢性乙肝患者T淋巴細(xì)胞亞群的影響，為減緩或阻止患者機(jī)體耐藥性的出現(xiàn)提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年10月—2019年3月石家莊市第五醫(yī)院收治的CHB患者61例，男41例，女20例；年齡23～78（51.4±11.6）歲。診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會與中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會聯(lián)合制定的《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》［7］，所有患者入選前均未用過抗病毒藥和免疫調(diào)節(jié)劑，且半年內(nèi)未用過降酶藥，血清甲、丙、戊、庚型肝炎病毒均為陰性。所有患者通過基因測序技術(shù)確認(rèn)所感染HBV發(fā)生病毒耐藥基因突變，根據(jù)病毒基因突變位點(diǎn)的個(gè)數(shù)分為單位點(diǎn)者（29例，只有一個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生突變）和多位點(diǎn)者（32例，有兩個(gè)或以上基因位點(diǎn)發(fā)生突變），根據(jù)HBV DNA載量分為低拷貝者（6例，HBV病毒載量拷貝數(shù)為102～103）、中拷貝者（22例，HBV病毒載量拷貝數(shù)為104～105）、高拷貝者（33例，HBV病毒載量拷貝數(shù)為106～108），根據(jù)患者病情程度分為輕度者（12例）、中度者（25例）、重度者（24例）。另選取30例健康人群為對照，男21例，女9例；年齡21～78（49.3±19.1）歲；納入標(biāo)準(zhǔn)為外周血肝功能完全正常且病毒標(biāo)志物全陰。

1.2 T淋巴細(xì)胞亞群檢測方法 無菌抽取EDTA抗凝血2 mL，用于T細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測，同時(shí)抽取外周靜脈血3 mL，離心5 min，分離血漿，用于HBV DNA載量、基因型及耐藥突變核酸測序的檢測。吸取10μL的白細(xì)胞分化抗原CD3+、CD4+、CD8+檢測試劑，加入無添加試管，將患者待測EDTA抗凝血充分混合后吸取100μL加入試管，在快速混勻器上震蕩混合，37℃避光孵育15 min，加入2 mL溶血素，震蕩混勻后，37℃避光孵育15 min，待液面清亮，以1 500 r/min速度離心5 min，棄上清，加入2 mL的0.9%生理鹽水，再次震蕩混勻，以1 500 r/min的速度離心5 min，棄上清，吸取400μL鞘液加入試管，充分震蕩混勻，使用流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHB患者HBV耐藥基因突變前后、健康人群CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較 CHB患者HBV發(fā)生耐藥基因突變前后、健康人群CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較見表1。

表1 CHB患者突變前后、健康人群CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較（%，±s）

表1 CHB患者突變前后、健康人群CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較（%，±s）

注：與健康人群比較，aP<0.05；與CHB患者突變前比較，bP<0.05。

入選對象CHB患者突變前CHB患者突變后健康人群n 61 61 30 CD3+T 67.233±11.557a 57.843±13.763ab 71.337±5.234 CD4+T 36.920±9.503a 28.802±9.727ab 40.913±5.526 CD8+T 25.505±7.427a 25.172±9.769a 27.795±6.117

2.2 不同位點(diǎn)HBV多聚酶基因P區(qū)位點(diǎn)突變后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較 不同位點(diǎn)HBV多聚酶基因P區(qū)位點(diǎn)突變后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞見表2。由表2可知，不同位點(diǎn)CHB患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較均無顯著性差異（P均>0.05）。

表2 不同位點(diǎn)HBV多聚酶基因P區(qū)位點(diǎn)突變后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞（%，±s）

表2 不同位點(diǎn)HBV多聚酶基因P區(qū)位點(diǎn)突變后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞（%，±s）

CHB患者單位點(diǎn)者多位點(diǎn)者n 29 32 CD3+T 63.559±9.044 61.242±13.704 CD4+T 34.459±8.102 32.555±9.599 CD8+T 24.266±6.117 23.818±6.996

2.3 不同HBV DNA載量HBV多聚酶基因P區(qū)位點(diǎn)突變后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較 不同HBV DNA載量HBV多聚酶基因P區(qū)位點(diǎn)突變后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞見表3。由表3可知，不同HBV DNA載量CHB患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均>0.05）。

表3 不同HBV DNA載量HBV多聚酶基因P區(qū)位點(diǎn)突變后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較（%，±s）

表3 不同HBV DNA載量HBV多聚酶基因P區(qū)位點(diǎn)突變后CHB患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較（%，±s）

CHB患者低拷貝者中拷貝者高拷貝者n6 22 33 CD3+T 62.625±8.386 62.179±12.041 60.532±14.846 CD4+T 35.425±2.666 32.821±8.686 33.220±10.241 CD8+T 22.575±7.705 25.364±5.660 22.000±7.708

2.4 不同病情HBV多聚酶基因P區(qū)位點(diǎn)突變后CHB患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較不同病情HBV多聚酶基因P區(qū)位點(diǎn)突變后CHB患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較見表4。

表4 不同病情HBV多聚酶基因P區(qū)位點(diǎn)突變后CHB患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較（%，±s）

表4 不同病情HBV多聚酶基因P區(qū)位點(diǎn)突變后CHB患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比較（%，±s）

注：與中度者比較，bP<0.05。

CHB患者輕度者中度者重度者n 12 25 24 CD3+T 61.642±12.254 60.992±8.968 52.663±17.092b CD4+T 32.575±9.997 28.928±7.554 26.783±11.303 CD8+T 25.208±10.042 27.928±9.312 22.283±9.659b

3 討論

CHB是常見的慢性傳染病之一，嚴(yán)重危害人民健康［8］。治療HBV的藥物主要是NAs、干擾素及中草藥［9］，國內(nèi)常用的NAs有LAM、ADV、恩替卡韋（ENV）及替比夫定（LdT）［10］。NAs可在患者體內(nèi)形成三磷酸活性成分結(jié)合到HBV聚合酶上，抑制HBV的復(fù)制［11］。而隨著用藥人群基數(shù)增大和用藥時(shí)間延長可導(dǎo)致HBV發(fā)生基因變異特別是HBV逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)的基因變異，從而導(dǎo)致產(chǎn)生的HBV聚合酶與NAs結(jié)合力降低，即變異的HBV不受NAs的抑制或抑制能力下降，在繼續(xù)應(yīng)用同一種NAs治療的情況下，HBV變異株因?qū)As不敏感而逐漸代替野生株，成為患者體內(nèi)的優(yōu)勢株，從而導(dǎo)致患者對于NAs的耐藥，發(fā)生病毒學(xué)反彈和血清學(xué)突破［12-13］。目前，臨床主要采取基因芯片技術(shù)和Sanger測序法對HBV主要的耐藥位點(diǎn)進(jìn)行檢測，監(jiān)測和指導(dǎo)臨床CHB治療［14］。

外周血T淋巴細(xì)胞亞群是反映HBV感染后各種臨床類型肝病細(xì)胞免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，T淋巴細(xì)胞亞群比例失調(diào)，對HBV的清除作用減弱，成為HBV復(fù)制及病情變化的主要原因［15］。T淋巴細(xì)胞亞群中，CD3+是成熟T細(xì)胞的共同分化抗原，代表外周血T細(xì)胞的總量，作為T細(xì)胞的識別單位，參與特異性抗原的識別，它的減少表示患者體內(nèi)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量減少，可能是參與免疫反應(yīng)而不斷“消耗”所致，CD3+T淋巴細(xì)胞減少的越明顯越不利于病情的改善［16］。而CD4+主要表達(dá)于T細(xì)胞的輔助細(xì)胞和抑制細(xì)胞的表面，在細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)中起協(xié)調(diào)作用，在免疫應(yīng)答中起中心作用；CD8+T淋巴細(xì)胞分布于殺傷性T淋巴細(xì)胞表面的，在被細(xì)胞因子激活后，產(chǎn)生穿孔素和顆粒酶破壞靶細(xì)胞，是機(jī)體清除細(xì)胞內(nèi)病毒的主要機(jī)制［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者由于CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯下降，可導(dǎo)致HBV特異性CD8+T淋巴細(xì)胞減少，對HBV的清除力減弱［18］。

本研究對乙肝患者體內(nèi)病毒發(fā)生耐藥基因突變前后患者CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)乙肝患者突變前CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞均低于正常組，且發(fā)生耐藥基因突變后CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞相比突變前明顯降低，此結(jié)果表明CHB患者體內(nèi)持續(xù)存在著HBV感染，對機(jī)體CD3+T淋巴細(xì)胞不斷消耗，CD4+T淋巴細(xì)胞功能亦減弱，對HBV的清除作用減弱，尤其是發(fā)生耐藥突變后，致使CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞功能進(jìn)一步減弱，即T淋巴細(xì)胞清除HBV的能力進(jìn)一步減弱，HBV病毒增殖不受抑制，所以易發(fā)生病毒學(xué)反彈。另外在本研究中將這61位患者在確認(rèn)體內(nèi)HBV發(fā)生耐藥基因突變后，按照患者病情輕重進(jìn)行分組發(fā)現(xiàn)，隨病情加重，CHB患者的CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的均呈現(xiàn)降低的趨勢，三組之間比較，輕、中度差異不大，主要是CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞降低，但是重度者CD3+、CD8+T淋巴細(xì)胞較中度者明顯下降，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明發(fā)生耐藥基因突變后，在病情反彈早期，即輕、中度階段，患者機(jī)體T淋巴細(xì)胞亞群主要是CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞的不斷被消耗，CD4+T淋巴細(xì)胞所協(xié)調(diào)的免疫應(yīng)答的功能不斷降低，導(dǎo)致對HBV清除能力進(jìn)一步降低，而隨病情加重，最終導(dǎo)致更多CD8+T淋巴細(xì)胞的參與到清除病毒的反應(yīng)中，通過細(xì)胞免疫進(jìn)行清除病毒，所以病情嚴(yán)重時(shí)CD8+T淋巴細(xì)胞消耗嚴(yán)重，從而導(dǎo)致病毒增殖進(jìn)一步活躍，導(dǎo)致病情加重，所以CD8+T淋巴細(xì)胞功能受損可能是乙肝患者機(jī)體發(fā)生耐藥后病情加重的機(jī)制之一。

研究［19］顯示，CHB出現(xiàn)病毒基因突變發(fā)生耐藥主要以單一位點(diǎn)突變模式為主，但是也出現(xiàn)了多位點(diǎn)混合突變的模式。本研究發(fā)現(xiàn)，單位點(diǎn)者與多位點(diǎn)者相比，CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞隨耐藥基因突變位點(diǎn)增多相比呈下降趨勢，表明CHB患者T淋巴細(xì)胞隨突變基因位點(diǎn)增多而消耗增多，導(dǎo)致病毒復(fù)制活躍。而HBV病毒載量的高低與特異性T淋巴細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)［20］。本研究將所有CHB患者按HBV DNA復(fù)制量的大小進(jìn)一步分組比較，低、中、高各復(fù)制組CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞呈逐漸下降的趨勢，CD8+T淋巴細(xì)胞。從研究結(jié)果分析隨病毒復(fù)制量增加，CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞不斷消耗增多，但是隨病毒增殖活躍，CD8+T淋巴細(xì)胞被大量激活使增高，但是如果病毒沒被抑制，則由于病毒大量復(fù)制被大量消耗，導(dǎo)致CD8+T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)受損，所以病毒復(fù)制更加活躍，促使病情加重。

總之，CHB患者感染HBV后，體內(nèi)外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞的明顯降低，當(dāng)HBV發(fā)生耐藥基因突變后，患者體內(nèi)CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步降低，對HBV的清除能力降低，而且發(fā)生HBV耐藥基因突變后，隨病情不斷加重，患者CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞的消耗不斷增多，尤其在病情嚴(yán)重期，患者CD8+T淋巴細(xì)胞亦消耗增多；另外隨突變位點(diǎn)數(shù)目增多，病毒載量增高，CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞均呈降低趨勢，所以患者在抗病毒治療過程中應(yīng)定期監(jiān)測CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞，尤其是CD4+T淋巴細(xì)胞，當(dāng)發(fā)現(xiàn)CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞降低明顯，病毒反彈，應(yīng)考慮有基因突變的發(fā)生，以便及時(shí)調(diào)整治療方案，在患者病情處于輕度、中度時(shí)及時(shí)采取免疫療法，激活患者機(jī)體免疫細(xì)胞的功能，尤其是CD8+T淋巴細(xì)胞的功能，應(yīng)該更有利于清除發(fā)生耐藥基因突變的病毒，甚至可能延緩或防止耐藥的發(fā)生，這是一條CHB患者抗病毒治療的思路，還需進(jìn)一步研究。