安慧仙，劉鵬云，紀兆樂，秦超師，周海佳，孫闖，李煒，曾廣偉

1西安國際醫(yī)學中心醫(yī)院心內(nèi)科，西安 710100；2空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院心內(nèi)科

促紅細胞生成素衍生肽腹腔注射對小鼠阿霉素的阿霉素（DOX）是一種被廣泛使用的一線抗癌藥物，常與其他藥物合用聯(lián)合治療各種癌癥如血液系統(tǒng)癌（白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤）和實體器官癌（乳腺癌、甲狀腺癌、肉瘤、骨肉瘤等）［1-4］。然而，DOX存在劑量依賴的耐藥性和容易引起嚴重心臟毒性反應，限制了其臨床應用［5］。因此，尋找防治DOX心臟毒性的藥物成為拓展DOX臨床應用的重點和熱點。

促紅細胞生成素（EPO）是一種內(nèi)源性糖蛋白激素，刺激紅細胞生成，在臨床上常用于治療由慢性腎病、人類免疫缺陷病毒和化療引起的貧血［6］。大劑量的EPO對組織器官具有保護作用，但會導致血栓形成、中風或高血壓等嚴重不良作用。促紅細胞生成素衍生肽即螺旋B表面肽（HBSP）是從促紅細胞生成素（EPO）螺旋B的水表面衍生出來的11個氨基酸序列，其在多種組織中具有保護作用［7］。長期服用HBSP可預防心肌梗死后擴張型心肌?。?］。同時，研究表明HBSP能通過激活PI3K/Akt信號改善心肌細胞缺氧/復氧損傷［9］。然而HBSP在改善DOX誘發(fā)的心臟毒性作用的機制還不清楚。2020年5月—2021年6月，我們在對小鼠腹腔注射DOX的同時，注射HBSP，觀察小鼠的心臟功能及心肌結(jié)構(gòu)以評估HBSP對DOX心臟毒性作用的防治效果；檢測心肌組織中凋亡及自噬相關(guān)蛋白（Cleaved Caspase-3、Cytochrome C、LC3B、Beclin1、LAMP2、p62）和信號通路相關(guān)蛋白（p-PI3K、p-Akt）以探討HBSP對DOX心臟毒性作用的防治作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 40只8周齡健康雄性C57/bl6小鼠購于西安交通大學實驗動物中心，體質(zhì)量25～30 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2018-001。DOX購于Sigma公司，HBSP購于上?？齐纳锟萍加邢薰?，肌鈣蛋白T（cTnT）試劑盒購于南京建成生物公司，Cleaved Caspase-3、Cytochrome C、LC3B、Be‐clin1、LAMP2和p62抗體均購于Cell Signaling Tech‐nology公司，GAPDH、山羊抗鼠和山羊抗兔抗體購于北京中衫金橋生物技術(shù)公司。多道生理記錄儀MP150購自美國BIOPAC公司，蛋白免疫印跡化學發(fā)光儀購自美國伯樂公司，酶標儀購自美國賽默飛公司。

1.2 C57BL/6小鼠分組及DOX、HBSP、LY294002的腹腔注射方法 40只C57BL/6小鼠在動物房適應性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為4組，每組10只。藥物的腹腔注射方法參照文獻［7，10］進行。HBSP+LY294002組：一次性腹腔注射DOX（15 mg/kg），并腹腔注射30μg/（kg·d）的HBSP和20 mg/（kg·d）的LY294002，連續(xù)7 d；HBSP組：一次性腹腔注射DOX（15 mg/kg），并腹腔注射30μg/（kg·d）的HBSP，連續(xù)7 d；DOX組：一次性腹腔注射DOX（15 mg/kg）；對照組（Con‐trol）：腹腔注射生理鹽水。

1.3 小鼠心臟功能的檢測

1.3.1 小鼠心臟收縮和舒張功能的檢測 DOX腹腔注射7 d后，將各組小鼠麻醉并固定在動物手術(shù)臺，體視顯微鏡下辨別頸動脈并分離，穿線結(jié)扎遠端，在頸動脈做一小切口，將連有壓力傳感器的動脈套管針沿切口插入頸動脈直至左心室，采用多道生理記錄儀測量左室壓力上升最大速率（+dp/dtmax）和左室壓力下降最大速率（-dp/dtmax）。

1.3.2 小鼠血清中cTnT的檢測 采用ELISA法。DOX腹腔注射7 d后，將各組小鼠麻醉并固定在動物手術(shù)臺，剪開頸部皮膚，分離頸動脈并剪口取血；低溫2 000 g離心10 min，取上清凍存于–80℃冰箱備用。按照ELISA檢測試劑盒說明書步驟，酶標儀讀取各組血清的吸光值并根據(jù)公式計算出各組血清cTnT的含量。

1.4 小鼠心肌結(jié)構(gòu)的觀察 采用HE染色法。DOX腹腔注射7 d后，將各組小鼠麻醉并固定在動物手術(shù)臺，開胸游離心臟放入預冷PBS中沖洗以去除血液，然后將心臟放入4%多聚甲醛中室溫固定48 h；行常規(guī)石蠟包埋和切片方法；將石蠟切片在二甲苯和梯度乙醇中脫蠟復水，再行蘇木精和尹紅染色，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察各組心肌纖維結(jié)構(gòu)。

1.5 小鼠心肌組織凋亡蛋白（Cleaved Caspase-3、Cytochrome C）、自噬相關(guān)蛋白（Beclin1、p62、LAMP2、LC3B、p-PI3K和p-Akt）、信號通路（p-PI3K、p-Akt）相關(guān)蛋白的檢測 采用Western blotting法。剪取各組小鼠左室心肌組織并稱重，用預冷PBS沖洗殘余血液，2 000 g、4℃離心10 min，棄上清，并向沉淀中按照1∶5的比例加入裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和RIPA），冰上研磨裂解30 min后，12 000 g、4℃離心30 min，取上清，行BCA法蛋白定量；常規(guī)SDS-PAGE膠電泳、濕轉(zhuǎn)，室溫下5 %脫脂奶粉封閉2 h，將目的蛋白條帶放入相應的抗體管中孵育：Cleaved Caspase-3（1∶1 000）、Cytochrome C（1∶1 000）、Beclin1（1∶1 000）、p62（1∶1 000）、LAMP2（1∶1 000）、LC3B（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000），4℃搖床過夜；次日，TBST室溫洗滌3次，每次10 min，用HRP標記的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗（1∶5 000）室溫搖床孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min；Bio-rad化學發(fā)光儀檢測目的條帶的灰度，并用Image Lab軟件對條帶灰度進行分析統(tǒng)計，以目的蛋白與相應GAPDH條帶灰度的比值表示各組蛋白相對表達水平。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心臟功能比較 與Control組相比，DOX組+dp/dt、–dp/dt降低，血清cTnT的含量增加（P<0.05）；與DOX組相比，HBSP組+dp/dt、–dp/dt增加，血清中cTnT含量降低（P<0.05）；與HBSP組比較，HBSP+LY294002組+dp/dt、–dp/dt降低，血清cTnT含量增加（P均<0.05）。詳見表1。

表1 各組心臟功能比較（±s）

表1 各組心臟功能比較（±s）

注：與Control組比較，*P<0.05；與DOX組比較，#P<0.05；與HBSP組比較，^P<0.05。

組別DOX+HBSP+LY294002組DOX+HBSP組DOX組Control組+dp/dt 4 270±245^5 907±306#4 187±235*7 913±270-dp/dt 3 413±312^4 500±306#3 370±207*5 557±285 cTnT 25.1±1.51^11.6±0.91#26.0±2.39*7.5±0.74

2.2 各組心肌結(jié)構(gòu)比較 HE染色結(jié)果顯示，Con‐trol組心肌纖維排列整齊，胞質(zhì)無空泡化現(xiàn)象；DOX組心肌纖維排列不規(guī)則并出現(xiàn)明顯胞質(zhì)空泡化；與DOX組比較，HBSP組心肌纖維排列改善，胞質(zhì)空泡化明顯減輕；與HBSP組比較，HBSP+LY294002組心肌纖維排列不整齊，并再次出現(xiàn)明顯的胞質(zhì)空泡化現(xiàn)象。詳見圖1。

圖1 各組小鼠光學顯微鏡下心肌結(jié)構(gòu)（×200）

2.3 各組心肌組織凋亡蛋白、自噬相關(guān)蛋白及信號通路相關(guān)蛋白的相對表達量比較 與Control組比較，DOX組心肌組織中Cleaved Caspase-3、Cyto‐chrome C的相對表達量增加（P均<0.05）；與DOX組比較，HBSP組Cleaved Caspase-3、Cytochrome C的相對表達量減少（P均<0.05）；與HBSP組比較，HB‐SP+LY294002組Cleaved Caspase-3、Cytochrome C的相對表達量增加（P均<0.05），詳見表2。

與Control組比較，DOX組心肌組織中Beclin1、p62、LAMP2蛋白的相對表達量及LC3BII/LC3BI升高（P均<0.05）；與DOX組比較，HBSP組Beclin1、p62、LAMP2蛋白的相對表達量以及LC3BII/LC3BI降低（P均<0.05）；與HBSP組 比 較，HBSP+LY294002組心肌組織中Beclin1、p62、LAMP2相對表 達 量 及LC3BII/LC3BI升高（P均<0.05），詳見表3。

表2 各組Cleaved Caspase-3、Cytochrome C蛋白相對表達量比較（±s）

表2 各組Cleaved Caspase-3、Cytochrome C蛋白相對表達量比較（±s）

注：與Control組比較，*P<0.05；與DOX組比較，#P<0.05；與HBSP組比較，^P<0.05。

組別HBSP+LY294002組HBSP組DOX組Control組Cleaved Caspase-3 2.73±0.42^1.27±0.15#2.80±0.25*1.16±0.13 Cytochrome C 3 413±312^1.15±0.14#2.20±0.20*1.09±0.18

表3 各組Beclin1、p62、LAMP2、LC3B蛋白相對表達量比較（±s）

表3 各組Beclin1、p62、LAMP2、LC3B蛋白相對表達量比較（±s）

注：與Control組比較，*P<0.05；與DOX組比較，#P<0.05；與HBSP組比較，^P<0.05。

組別HBSP+LY294002組HBSP組DOX組Control組Beclin1 2.14±0.29^1.18±0.13#2.21±0.20*1.10±0.08 p62 2.37±0.33^1.22±0.19#2.48±0.36*1.08±0.11 LAMP2 2.43±0.15^1.07±0.18#2.53±0.17*1.13±0.14 LC3B 2.51±0.26^1.24±0.16#2.62±0.14*1.05±0.18

與Control組比較，DOX組心肌組織中p-PI3K和p-Akt蛋白相對表達量降低（P均<0.05）；與DOX組比較，HBSP組心肌組織中p-PI3K和p-Akt蛋白的相對表達量增加（P均<0.05）；與HBSP組比較，HBSP+LY294002組p-PI3K、p-Akt蛋白的相對表達量降低（P均<0.05），詳見表4。

表4 各組p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量比較（±s）

表4 各組p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達量比較（±s）

注：與Control組比較，*P<0.05；與DOX組比較，#P<0.05；與HBSP組比較，^P<0.05。

組別HBSP+LY294002組HBSP組DOX組Control組p-PI3K 2.73±0.42^1.27±0.15#2.80±0.25*1.16±0.13 p-Akt 2.13±0.31^1.15±0.14#2.20±0.20*1.09±0.18

3 討論

在接受蒽環(huán)類藥物如DOX治療的成年患者中約有9%的患者會出現(xiàn)心臟毒性，并呈劑量依賴性和時間依賴性，這成為導致腫瘤患者不良預后的重要原因［11］。DOX引起的心臟毒性嚴重限制其臨床應用，然而臨床上可用于防治DOX的藥物很少。目前DOX心臟毒性作用較為明確的兩種機制是活性氧的生成以及對細胞DNA和不同細胞內(nèi)蛋白的損傷，破壞拓撲異構(gòu)酶介導的DNA修復［12-13］。除此以外，我們前期的結(jié)果和其他研究報道都證實自噬是DOX引起心臟毒性的重要原因，但具體機制還未完全闡明。

DOX心臟毒性的主要病理表現(xiàn)是左心室功能障礙和心肌纖維結(jié)構(gòu)損傷［14］。使用DOX治療時，部分患者左心室功能會表現(xiàn)出劑量依賴性降低，并最終發(fā)展為充血性心力衰竭。在本研究中，DOX組小鼠左室功能降低，表現(xiàn)為+dp/dt和-dp/dt降低，血清cTnT含量增加；HE染色顯示DOX組心肌胞質(zhì)出現(xiàn)嚴重空泡化，這些結(jié)果表明DOX會導致心臟收縮和舒張功能損傷，并引起心肌纖維結(jié)構(gòu)的病理性改變。而HBSP組小鼠左室+dp/dt和-dp/dt升高，心肌胞質(zhì)空泡化減少，血清cTnT含量降低。這些結(jié)果說明HBSP可改善DOX心臟毒性。

研究表明，DOX引起心肌細胞凋亡和自噬加重，導致心肌細胞數(shù)量減少［15］。Caspase-3被剪切成Cleaved Caspase-3，以及Cytochrome C由線粒體釋放到胞質(zhì)，在細胞凋亡啟動和進展過程中發(fā)揮重要作用［16］。自噬在維持細胞穩(wěn)態(tài)和存活中發(fā)揮重要作用［17］。自噬是一個動態(tài)過程，包括自噬小體的形成、自噬溶酶體的形成以及自噬溶酶體內(nèi)含物的降解。LC3I/II、Beclin1、p62和LAMP2在自噬的動態(tài)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是檢測自噬的標志性蛋白［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，DOX組Cleaved Caspase-3和Cytochrome C的蛋白表達量增加，自噬相關(guān)蛋白LC3BII/LC3BI、Beclin1、p62和LAMP2的表達量也增加，表明DOX可誘導心肌細胞凋亡和自噬；而HBSP組Cleaved Caspase-3和Cytochrome c的蛋白表達降低，LC3BII/LC3BI、Beclin1、p62和LAMP2的表達降低，這說明HBSP能減輕DOX誘導的心肌細胞凋亡和自噬。

PI3K/Akt通路在細胞存活、增殖、生長、代謝和血管生成等過程中發(fā)揮重要作用［19］。有研究發(fā)現(xiàn)，DOX能通過下調(diào)PI3K/Akt通路誘導心肌細胞凋亡［20］。而PI3K抑制劑3-MA可抑制DOX誘導的心肌細胞自噬和凋亡。但PI3K/Akt通路是否參與HBSP對DOX心臟毒性的抑制作用還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，DOX組心肌組織中p-PI3K和p-Akt的表達降低，提示DOX抑 制PI3K/Akt通 路；HBSP組p-PI3K和p-Akt的表達升高，說明HBSP可激活PI3K/Akt通路，同時PI3K抑制劑LY294002能阻斷HBSP對PI3K/Akt通路的調(diào)控作用。

總之，HBSP可通過抑制細胞凋亡和自噬減輕DOX誘導的心臟毒性，而這一作用與調(diào)控PI3K/Akt信號有關(guān)。本實驗闡明了HBSP具有減輕DOX誘導的心臟毒性的作用，為臨床治療DOX誘導的心臟毒性提供了新的實驗和理論依據(jù)。但HBSP如何調(diào)控PI3K/Akt信號還不清楚，下一步將闡明HBSP對PI3K/Akt信號的調(diào)控機制。