胡懿化，魯靜武，何嘉琦，王星滟，張武霞*，李 鵬，張永坡，高春艷，岳愛琴，杜維俊，趙晉忠*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

隨著人們生活質(zhì)量的提高、保健意識的增強，保健食品受到人們青睞。如大蒜具有極好的抗菌效果，能夠預(yù)防血管老化、增強機體免疫力、預(yù)防感冒[1]；胡蘿卜、洋蔥等具有預(yù)防和治療夜盲癥、降糖降脂的作用[2-3]；植物大豆含有豐富的蛋白質(zhì)、多種氨基酸及微量元素，能夠增強人體的免疫功能和記憶力[4]。黑豆是一種藥食同源的豆科植物，我國約有2 980份種質(zhì)資源，其中青仁黑豆的藥用價值最高，具有抗氧化、降血脂、降血壓、改善貧血、預(yù)防癌癥、預(yù)防肥胖、抗腫瘤等功效[5]。Mu等[6]從黑豆皮中獲得的提取物能夠明顯提高機體血液中鐵含量，促進機體造血功能，改善貧血；洪迪清等[7]發(fā)現(xiàn)黑豆中的三羥基異黃酮能夠有效抑制肺癌、肝癌、結(jié)腸癌、食道癌等癌癥的發(fā)生，也可預(yù)防和治療高血壓、腦血栓，維護心臟功能。因此，開發(fā)利用黑豆資源具有重要意義。

作者在不同溫度下浸提黑豆皮，對黑豆皮提取物中的總黃酮、總酚、花青素、碳水化合物、蛋白質(zhì)和糖醛酸等6種活性成分進行分析，同時探究其抗氧化活性及抗腫瘤活性，以期為黑豆皮資源的商品化開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料與試劑

太谷青仁黑豆1號，產(chǎn)于山西太谷縣；人胃腺癌細(xì)胞株(BGC-823)、宮頸癌細(xì)胞株(HeLa)、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(NCI-H460)，自行保存；細(xì)胞培養(yǎng)基(RPMI-1640，DMEM)，美國HyClone公司。

噻唑藍(MTT)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清、胰蛋白酶，四季青生物公司。

1.2 方法

1.2.1 黑豆皮提取物的制備

收集高品質(zhì)黑豆皮，凈水清洗3遍，80 ℃不斷翻攪下烘焙40 min；稱取適量干黑豆皮4份，分別用70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的蒸餾水浸提30 min，過濾，濾液濃縮、凍干，即得黑豆皮提取物。

1.2.2 黑豆皮提取物中6種活性成分的測定

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用Al(NO3)3絡(luò)合分光光度法測定黑豆皮提取物中總黃酮的含量[8]；以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林酚法測定黑豆皮提取物中總酚的含量[9]；參照pH示差法測定黑豆皮提取物中花青素的含量[10]；以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用硫酸-苯酚法測定黑豆皮提取物中碳水化合物的含量[11]；以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍染色法測定黑豆皮提取物中蛋白質(zhì)的含量[12]；以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用間羥基聯(lián)苯法測定黑豆皮提取物中糖醛酸的含量[13]。

比較黑豆皮提取物中6種活性成分的含量，確定合適的浸提溫度。

1.2.3 黑豆皮提取物抗氧化活性的測定

取合適溫度下浸提的黑豆皮提取物，溶解并稀釋成不同濃度，測定其總還原力和對DPPH自由基的清除能力，體外評價其抗氧化活性[14-15]。具有還原能力的化合物能將鐵氰化鉀還原為亞鐵氰化鉀，并與三氯化鐵發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)物在702 nm處顯色，基于此，可通過測定702 nm處吸光度(OD702)來判斷化合物還原能力的強弱，OD702值越大，說明還原能力越強。DPPH自由基能夠和抗氧化劑反應(yīng)，測定溶液在517 nm處吸光度，通過計算DPPH自由基清除率來判斷抗氧化劑的活性，DPPH自由基清除率越高，抗氧化活性越高[16]。

1.2.4 黑豆皮提取物抗腫瘤活性的測定

取合適溫度下浸提的黑豆皮提取物，通過MTT法體外評估其對BGC-823、HeLa、NCI-H460細(xì)胞株增殖活性的影響[17]。將對數(shù)生長期的BGC-823、HeLa、NCI-H460細(xì)胞株分別用胰蛋白酶消化，并分別用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液；接種于96孔板，密度為1×106個·mL-1，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度(0.125 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1)合適溫度下浸提的黑豆皮提取物溶液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加入MTT處理4 h，棄上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜，測定570 nm處吸光度(OD處理組)。以磷酸鹽緩沖液替代黑豆皮提取物溶液作為空白組，同法測定570 nm處吸光度(OD空白組)，按下式計算抑制率(%)：

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，使用GraphPad Prism 5.0軟件完成統(tǒng)計繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑豆皮提取物中活性成分分析

在70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃下浸提的黑豆皮提取物中的總黃酮、總酚、花青素、碳水化合物、蛋白質(zhì)和糖醛酸等6種活性成分的含量如圖1所示。

圖1 黑豆皮提取物中6種活性成分的含量Fig.1 Contents of six active components in black bean hulls extract

由圖1可知，黑豆皮提取物中的總黃酮、總酚、花青素、蛋白質(zhì)和糖醛酸等5種活性成分的含量隨著浸提溫度的升高均呈先升高后降低的趨勢，在90 ℃時總黃酮、總酚、蛋白質(zhì)和糖醛酸的含量達到最高，分別為(11.555±0.160)%、(1.454±0.070)%、(13.096±0.600)%、(21.587±1.570)%；在80 ℃時花青素的含量達到最高，為(0.199±0.003)%；而黑豆皮提取物中碳水化合物的含量隨著浸提溫度的升高持續(xù)升高，在90 ℃時為(61.453±5.030)%，100 ℃時達到(65.566±1.448)%。

采用1.2.1方法在不同溫度下浸提的黑豆皮提取物的提取率順序為：90 ℃(7.957%)>100 ℃(7.904%)>70 ℃(5.356%)>80 ℃(5.343%)。綜合考慮，選擇合適的浸提溫度為90 ℃，在此溫度下浸提能夠最大程度地保留黑豆皮中的各種活性成分。

2.2 黑豆皮提取物的抗氧化活性分析

取80 ℃、90 ℃下浸提的黑豆皮提取物，體外測定其總還原力和DPPH自由基清除率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 黑豆皮提取物的總還原力(a)和DPPH自由基清除率(b)Fig.2 Total reducing power(a) and DPPH free radical scavenging rate(b) of black bean hulls extract

由圖2可知，90 ℃浸提的黑豆皮提取物的總還原力和DPPH自由基清除率均高于80 ℃浸提的；且2種溫度下浸提的黑豆皮提取物的總還原力和DPPH自由基清除率均隨提取物濃度的增加逐漸升高，呈線性關(guān)系。90 ℃浸提的黑豆皮提取物濃度為0.8 mg·mL-1時，其還原鐵離子和對DPPH自由基的清除能力均達到最強，鐵離子還原氧化值和DPPH自由基清除率分別達到1.364±0.120和(76.00±0.02)%。

2.3 黑豆皮提取物的抗腫瘤活性分析

取80 ℃、90 ℃下浸提的黑豆皮提取物，體外測定其對BGC-823、HeLa、NCI-H460細(xì)胞株增殖活性的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 黑豆皮提取物對BGC-823(a)、HeLa(b)、NCI-H460(c)細(xì)胞株增殖活性的影響Fig.3 Effect of black bean hulls extract on proliferative activity of BGC-823(a),HeLa(b),and NCI-H460(c)

由圖3可知，黑豆皮提取物具有抑制癌細(xì)胞增殖的作用。在濃度為0.25～2 mg·mL-1時，80 ℃下浸提的黑豆皮提取物能夠抑制BGC-823細(xì)胞株增殖，并呈濃度依賴關(guān)系，在濃度為0.125～2 mg·mL-1時，90 ℃下浸提的黑豆皮提取物也能夠抑制BGC-823細(xì)胞株增殖，并呈濃度依賴關(guān)系(圖3a)；在濃度為0.5～2 mg·mL-1時，黑豆皮提取物能夠抑制HeLa細(xì)胞株增殖，并呈濃度依賴關(guān)系(圖3b)；在濃度為0.5～2 mg·mL-1時，黑豆皮提取物能夠抑制NCI-H460細(xì)胞株增殖，并呈濃度依賴關(guān)系(圖3c)。90 ℃下浸提的黑豆皮提取物在濃度為0.125 mg·mL-1時就對BGC-823細(xì)胞株的增殖具有一定抑制效果，說明其對人胃腺癌細(xì)胞更加敏感。

2.4 討論

有報道指出，黑豆中含有豐富的黃酮類化合物、多酚類化合物、碳水化合物、蛋白質(zhì)和維生素等，能夠增強機體免疫力并調(diào)節(jié)機體激素水平，有效減輕婦女更年期綜合癥癥狀[18]。本研究對黑豆皮提取物中6種活性成分的熱穩(wěn)定性進行研究，發(fā)現(xiàn)90 ℃浸提的黑豆皮提取物中總黃酮、總酚、蛋白質(zhì)和糖醛酸的含量最高，而花青素在80 ℃時保留最多，碳水化合物在100 ℃時保留最多。這是由于，總黃酮、總酚等物質(zhì)的性質(zhì)較穩(wěn)定，在一定范圍內(nèi)隨著溫度的升高提取量逐漸增加[19-20]；花青素是一種熱敏性較高的物質(zhì)，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，溫度越高越容易被氧化分解[21]；碳水化合物是生命細(xì)胞結(jié)構(gòu)的主要成分和供能物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞活動的重要功能，眾多研究表明溫度對碳水化合物結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的影響較小[22]，因此，100 ℃浸提的黑豆皮提取物中碳水化合物含量最高。

已有大量的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究證實，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致各種疾病發(fā)生的關(guān)鍵機制，減少機體內(nèi)自由基的產(chǎn)生是有效調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的重要策略[23]。機體內(nèi)過多的活性氧(如氧自由基)引起的氧化應(yīng)激是人類多種疾病發(fā)生發(fā)展與人體衰老的一個重要因素[24]。植物中抗氧化活性成分主要有黃酮類化合物、多酚類化合物、維生素和多糖等，其中花青素是目前最有效的抗氧化劑，也是最強效的自由基清除劑[25-26]。

本研究發(fā)現(xiàn)黑豆皮提取物具有較強的抗氧化活性，對DPPH自由基的清除率達到了(76.00±0.02)%，鐵離子還原氧化值達到了1.364±0.120。這與李勇等[27]研究發(fā)現(xiàn)黑豆皮具有抗氧化活性的結(jié)果相印證。同時推測槲皮素、異鼠李素、染料木素、豆素和原兒茶酸甲酯等物質(zhì)與花青素、多糖協(xié)同參與了黑豆皮提取物的抗氧化作用，有效地抑制和清除自由基，減少機體的氧化損傷。

本研究還發(fā)現(xiàn)黑豆皮提取物能夠有效抑制BGC-823、HeLa和NCI-H460細(xì)胞株的增殖。低濃度時，黑豆皮提取物促進癌細(xì)胞增殖；達到一定濃度時，抑制癌細(xì)胞增殖。這應(yīng)該與黑豆皮提取物中各活性成分所占比例有關(guān)。黑豆皮提取物中碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)含量高，所以低濃度時營養(yǎng)物質(zhì)首先提供營養(yǎng)和能量促進癌細(xì)胞增殖，隨著濃度的升高，花青素、黃酮等具有抗腫瘤活性的化合物發(fā)揮作用，抑制癌細(xì)胞增殖。Singh等[28]和Wang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，大豆皂酚B和染料木黃酮能夠促進大腸癌細(xì)胞的凋亡和自噬，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成，因此推測黑豆皮提取物中可能含有皂酚B、染料木黃酮等其它活性成分協(xié)同參與了抗腫瘤作用。

3 結(jié)論

在90 ℃下用蒸餾水浸提黑豆皮獲得的黑豆皮提取物中總黃酮、總酚、蛋白質(zhì)和糖醛酸保留最多，含量分別為(11.555±0.160)%、(1.454±0.070)%、(13.096±0.600)%、(21.587±1.570)%；花青素含量在80 ℃浸提時達到最高，為(0.199±0.003)%；而碳水化合物的含量則在100 ℃浸提時達到最高，為(65.566±1.448)%。黑豆皮提取物具有顯著的抗氧化和抗腫瘤活性，能夠有效抑制機體自由基的產(chǎn)生，增強免疫力，預(yù)防和抑制機體發(fā)生癌變，降低癌癥發(fā)生幾率。表明黑豆皮提取物能夠作為一種天然抗氧化或抗腫瘤的調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于食品藥品行業(yè)，為黑豆皮資源的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)利用奠定了重要基礎(chǔ)。