趙 錦，王雯潔，王晨晨，巨修練

(1.湖北輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.輝瑞(武漢)研究開發(fā)有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430000；3.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430205)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性遞質(zhì)，可作用于細(xì)胞膜上的GABA門控氯離子通道(GABA-gated chloride channel，GABACl)，使氯離子內(nèi)流導(dǎo)致細(xì)胞膜超極化，從而抑制生物體的神經(jīng)活動(dòng)[1-3]。GABACl是一種五聚體蛋白，又被稱為離子型GABA受體(以下簡(jiǎn)稱GABA受體)，廣泛存在于昆蟲的神經(jīng)和肌肉細(xì)胞中。GABA受體的拮抗劑已有很多被開發(fā)成農(nóng)用殺蟲劑，如氟蟲腈等，但隨著該類殺蟲劑的大量使用，出現(xiàn)了害蟲抗藥性和環(huán)境不友好等問(wèn)題[1-3]。近年來(lái)報(bào)道的兩類新型GABA受體拮抗劑：異噁唑啉類化合物(如Fluralaner)[3-5]和間二酰胺類化合物(如BPB-1)[6-7]，它們可以作用于GABA受體的一個(gè)新位點(diǎn)，同時(shí)選擇性高，對(duì)哺乳動(dòng)物低毒甚至無(wú)毒，較傳統(tǒng)殺蟲劑更安全[8]。因此，基于GABA受體的這一新作用位點(diǎn)研究Fluralaner等異噁唑啉類化合物的作用機(jī)制，可以為合理設(shè)計(jì)新型安全高效殺蟲劑提供重要的理論依據(jù)。

探尋與Fluralaner具有相似作用機(jī)制和活性結(jié)構(gòu)的新化學(xué)實(shí)體具有重要意義。作者采用分子模擬和計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)方法，以序列一致性較高的人GABA受體為模板，同源模建黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)GABA受體的三維結(jié)構(gòu)，探索Fluralaner的作用模式，并通過(guò)藥效團(tuán)模型和分子對(duì)接的虛擬篩選探尋GABA受體拮抗劑的新型苗頭化合物。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 藥效團(tuán)模型的構(gòu)建和驗(yàn)證

選擇10個(gè)結(jié)構(gòu)多樣且活性高的Fluralaner衍生物(表1)用于藥效團(tuán)模型的構(gòu)建[9]，運(yùn)用SYBYL-X 2.1軟件Sketch模塊構(gòu)建這10個(gè)化合物，并通過(guò)Compute命令對(duì)化合物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，獲取合理的分子構(gòu)象。具體方式如下：設(shè)定Tripos立場(chǎng)，添加Gasteiger-Huckel電荷，終止時(shí)的梯度差設(shè)為0.005kcal·mol-1·?-1，最大重復(fù)次數(shù)設(shè)為1 000，其余參數(shù)保持不變。藥效團(tuán)模型的構(gòu)建通過(guò)SYBYL-X 2.1軟件Galahad模塊完成，參數(shù)設(shè)置為系統(tǒng)默認(rèn)。

表1 10個(gè)Fluralaner衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)草地貪夜蛾的殺蟲活性(LC50)

為了驗(yàn)證構(gòu)建的藥效團(tuán)模型是否具有良好的識(shí)別活性化合物的能力，采用誘餌集方法計(jì)算陽(yáng)性分子富集因子(enrichment factor，EF)來(lái)評(píng)價(jià)模型的可靠性，計(jì)算公式如下：

式中：TP為命中陽(yáng)性分子的數(shù)量；n為所有命中分子的數(shù)量；A為所有陽(yáng)性分子的數(shù)量；N為數(shù)據(jù)庫(kù)的分子數(shù)量。

誘餌集方法的實(shí)驗(yàn)步驟如下：從ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇338個(gè)無(wú)活性的化合物分子，同時(shí)選出12個(gè)已知活性但未用于構(gòu)建藥效團(tuán)模型的分子共同作為陽(yáng)性參照分子，然后將這350個(gè)分子進(jìn)行能量?jī)?yōu)化后構(gòu)建一個(gè)小型數(shù)據(jù)庫(kù)用于虛擬篩選。通過(guò)SYBYL-X 2.1軟件Unity模塊將構(gòu)建的藥效團(tuán)模型生成提問(wèn)式，對(duì)該數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，計(jì)算富集因子。

1.2 同源模建

1.2.1 模型構(gòu)建

從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中下載黑腹果蠅GABA受體β亞基序列(編號(hào)：P25123)，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)人GABA受體(PDB ID：4COF)β亞基與其序列一致性最高，為46.28%，故選用人GABA受體蛋白4COF作為模板。在同源模建前刪去模板蛋白小分子配體，通過(guò)Swiss-model網(wǎng)站自動(dòng)執(zhí)行黑腹果蠅GABA受體的同源模建。

1.2.2 蛋白優(yōu)化

采用GROMACS 2016.5軟件對(duì)模建的黑腹果蠅GABA受體蛋白進(jìn)行3 ns的自由模擬以消除不合理的鍵長(zhǎng)、鍵角和扭轉(zhuǎn)角。利用pdb2gmx命令在AMBER99SB立場(chǎng)下生成蛋白的拓?fù)湮募10]，然后將模型置于填充有TIP3P水模型和氯離子的立方體盒子中。為消除不合理的范德華力，通過(guò)多次迭代計(jì)算使模型能量收斂到10 kJ·mol-1，接著使整個(gè)體系在300 K恒溫條件下達(dá)到NVT和NPT平衡，最后進(jìn)行3 ns時(shí)長(zhǎng)的自由模擬[3，11]。

1.2.3 蛋白評(píng)價(jià)

通過(guò)SAVEs在線蛋白檢測(cè)服務(wù)器(http://services.mbi.ucla.edu/saves/)和PROSA程序(https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php)來(lái)評(píng)價(jià)蛋白模型[3]。利用PROCHECK方法進(jìn)行拉氏圖評(píng)價(jià)，同時(shí)結(jié)合Z-score分布圖來(lái)驗(yàn)證蛋白模型的質(zhì)量。

1.3 分子對(duì)接

運(yùn)用SYBYL-X 2.1軟件Surflex-Dock Geom模塊進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)。在對(duì)接之前需要進(jìn)行蛋白質(zhì)準(zhǔn)備，在對(duì)動(dòng)力學(xué)優(yōu)化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析之后，對(duì)其進(jìn)行側(cè)鏈修復(fù)、末端處理、加氫、加電荷等優(yōu)化。同源模建的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中不包含共晶配體，因此使用殘基模式來(lái)設(shè)定結(jié)合口袋。文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)luralaner等異噁唑啉類化合物與黑腹果蠅GABA受體相互作用的關(guān)鍵氨基酸可能是Ile218、Leu222、Gly277、Phe280、Val281[12-13]，因此選擇黑腹果蠅GABA受體模型A鏈上的Ile218、Leu222和B鏈上的Gly277、Phe280、Val281附近3 ?以內(nèi)的氨基酸來(lái)定義結(jié)合口袋[3]。

1.4 虛擬篩選

通過(guò)基于配體的藥效團(tuán)篩選和基于受體的分子對(duì)接對(duì)ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)中可購(gòu)買的22 724 825個(gè)化合物進(jìn)行虛擬篩選。首先將構(gòu)建的藥效團(tuán)模型生成提問(wèn)式，采用Flex Search對(duì)ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行初步篩選，然后將初篩所得的分子對(duì)接到模建蛋白的結(jié)合口袋中，結(jié)合Total_Score和Cscore值進(jìn)行進(jìn)一步篩選。觀察經(jīng)過(guò)兩次篩選后的小分子與GABA受體的結(jié)合模式，優(yōu)先考慮能與結(jié)合口袋中關(guān)鍵氨基酸形成相互作用的化合物。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥效團(tuán)模型

最優(yōu)的藥效團(tuán)模型分子疊合圖如圖1所示。

：疏水中心 ：氫鍵受體 ：正氮原子

該模型具有3個(gè)氫鍵受體(AA_1、AA_6、AA_7)、5個(gè)疏水中心(HY_3、HY_9、HY_4、HY_2、HY_8)和1個(gè)正氮原子(NP_5)，代表了異噁唑啉類化合物的關(guān)鍵藥效結(jié)構(gòu)特征。計(jì)算表明，該模型具有相對(duì)高的Specificity值(5.394)和相對(duì)低的Energy值(-0.51 kcal·mol-1)，富集因子為15.4，遠(yuǎn)大于1，證明該藥效團(tuán)模型具有較好的活性分子識(shí)別能力，故利用藥效團(tuán)模型進(jìn)行后續(xù)的虛擬篩選具有合理性。

2.2 同源模建

2.2.1 序列比對(duì)

同源模建是預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)合理三維結(jié)構(gòu)的有效方法，模板的選擇和序列比對(duì)的精確度是決定模建蛋白質(zhì)質(zhì)量的重要因素。黑腹果蠅GABA受體β亞基和人GABA受體β亞基的序列一致性為46.28%，符合建模要求。此外，在解析人GABA受體4COF的三維結(jié)構(gòu)時(shí)，在TM3和TM4的細(xì)胞內(nèi)環(huán)區(qū)域氨基酸Arg357～Ser564被序列SQPARAA替換[14]，故黑腹果蠅的GABA受體β亞基序列的相同位置也用SQPARAA替換。黑腹果蠅GABA受體β亞基和人GABA受體β亞基的序列比對(duì)如圖2所示，整個(gè)跨膜區(qū)域(TM1～TM4)氨基酸殘基的一致性和相似性較高，因此選擇人GABA受體作為模板具有合理性。

圖2 黑腹果蠅與人GABA受體β亞基的序列比對(duì)Fig.2 Sequence alignment of GABA receptor β subunits of Drosophila melanogaster and human

2.2.2 蛋白優(yōu)化

同源模建后的蛋白質(zhì)通過(guò)3 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)行優(yōu)化，在模擬過(guò)程中，黑腹果蠅GABA受體結(jié)構(gòu)的勢(shì)能變化和骨架碳原子(Cα)的均方根偏差(root mean square deviation，RMSD)如圖3所示。

由圖3a可以看出，當(dāng)能量收斂到設(shè)置范圍10 kJ·mol-1時(shí)，優(yōu)化步數(shù)達(dá)到2 718步，此時(shí)整個(gè)蛋白質(zhì)體系達(dá)到能量最小化。由圖3b可以看出，在1 600 ps后，黑腹果蠅GABA受體RMSD值達(dá)到收斂，穩(wěn)定在0.16 nm左右，這表明所得模型已基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，可用于分子對(duì)接。

圖3 黑腹果蠅GABA受體模型的3 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中的勢(shì)能(a)和骨架碳原子RMSD(b)變化Fig.3 Potential energy(a) and carbon skeleton RMSD(b) of Drosophila melanogaster GABA receptor model during 3 ns molecular dynamics simulation

2.2.3 蛋白評(píng)價(jià)

模建得到黑腹果蠅GABA受體的PROCHECK結(jié)果(圖4左)表明，模型中落在最佳和允許區(qū)域的氨基酸殘基總和為99.6%。因此，經(jīng)過(guò)動(dòng)力學(xué)優(yōu)化后的黑腹果蠅GABA受體的二面角是合理的。描述模型質(zhì)量的Z-score分布圖(圖4右)顯示，黑腹果蠅GABA受體模型的Z-score值為-3.16，落在了已知結(jié)構(gòu)蛋白的Z-score值形成的分布區(qū)內(nèi)，這表明模型能量也是合理的。上述評(píng)價(jià)結(jié)果表明，構(gòu)建的黑腹果蠅GABA受體模型結(jié)構(gòu)和能量均較為合理，可運(yùn)用于分子對(duì)接研究。

圖4 黑腹果蠅GABA受體模建蛋白的拉氏圖(左)和Z-score圖(右)Fig.4 Ramachandran plot(left) and Z-score plot(right) of optimized GABA receptor model of Drosophila melanogaster

2.3 分子對(duì)接

Fluralaner與黑腹果蠅GABA受體的對(duì)接模式如圖5所示。對(duì)接打分Total_Score值為5.47，Cscore值為5，表明其與黑腹果蠅GABA受體有較強(qiáng)的結(jié)合能力[15-16]。

從圖5可以看出，F(xiàn)luralaner垂直地插入到黑腹果蠅GABA受體模型TM1和TM3之間靠近細(xì)胞外膜的間隙區(qū)域(圖5a)，其含有三氟甲基的脂肪尾鏈嵌入2個(gè)亞基之間，并通過(guò)與Ile218、Leu222、Leu250、Met256形成疏水作用來(lái)維持自身與蛋白質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定性[3]。而Fluralaner空間位阻較大的異噁唑啉環(huán)(B)和苯環(huán)(C)未能完全嵌入該口袋中(圖5b)。此外，F(xiàn)luralaner異噁唑啉環(huán)上的O原子和N原子均能與殘基Ala285形成氫鍵作用(表2)，同時(shí)苯環(huán)(B)可與殘基Phe280形成π-π相互作用(圖5b)，這些作用可能是Fluralaner與GABA受體穩(wěn)定結(jié)合的原因。

圖5 Fluralaner與黑腹果蠅GABA受體的對(duì)接模式Fig.5 Docking mode of Fluralaner with Drosophila melanogaster GABA receptor

表2 Fluralaner與黑腹果蠅GABA受體結(jié)合形成的氫鍵

2.4 虛擬篩選

根據(jù)所建立的藥效團(tuán)模型和分子對(duì)接方法，對(duì)ZINC可購(gòu)買小分子數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行3輪虛擬篩選。在第1輪篩選中，利用Unity模塊將最優(yōu)的藥效團(tuán)模型轉(zhuǎn)化成提問(wèn)式，對(duì)ZINC可購(gòu)買化合物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，得到18 886個(gè)化合物，然后以QFIT>50為標(biāo)準(zhǔn)篩選出115個(gè)化合物；在第2輪篩選中，通過(guò)SYBYL-X 2.1軟件Surflex-Dock Geom模塊將這115個(gè)化合物對(duì)接到黑腹果蠅GABA受體的結(jié)合口袋中，綜合考慮候選化合物的Total_Score值和Cscore值，選擇排名前20且打分高于Fluralaner的化合物作為備選；在第3輪篩選中，通過(guò)觀察候選化合物與氨基酸殘基Leu222、Met256、Phe280、Ala285的相互作用來(lái)判斷對(duì)接模式是否具有合理性，從而剔除14個(gè)化合物，最終得到6個(gè)苗頭化合物，其對(duì)接打分見表3,化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖6。

圖6 篩選得到的6個(gè)苗頭化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.6 Chemical structures of screened six hit compounds

表3 篩選得到的6個(gè)苗頭化合物的對(duì)接打分

化合物N1與黑腹果蠅GABA受體的對(duì)接模式

如圖7所示。

圖7 化合物N1與黑腹果蠅GABA受體的對(duì)接模式Fig.7 Docking mode of compound N1 with Drosophila melanogaster GABA receptor

由圖7可知，與Fluralaner類似，化合物N1垂直地插入黑腹果蠅GABA受體模型TM1和TM3之間(圖7a)，但深度不及Fluralaner，這可能是因?yàn)镹1苯環(huán)支鏈的體積比Fluralaner脂肪長(zhǎng)鏈更大，容易與氨基酸發(fā)生碰撞，不利于深入結(jié)合口袋[3]。此外，化合物N1可以與Phe280形成π-π堆積作用，與氨基酸殘基Ile218、Pro219、Met256、Asp273、Leu276、Val281形成疏水作用?；衔颪1與Ala285并未形成氫鍵作用，但卻可以與Gln215、Met256、Asn260等氨基酸形成氫鍵作用。

3 結(jié)論

針對(duì)黑腹果蠅離子型GABA受體靶標(biāo)及其新型拮抗劑進(jìn)行了系統(tǒng)分子模擬，構(gòu)建了異噁唑啉類化合物Fluralaner的藥效團(tuán)模型，通過(guò)同源模建和分子對(duì)接探索了Fluralaner與黑腹果蠅GABA受體的可能作用模式。隨后基于藥效團(tuán)以及分子對(duì)接的虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)潛在的黑腹果蠅GABA受體新型拮抗劑，為靶向GABA受體新型殺蟲劑的設(shè)計(jì)和研究提供了重要理論依據(jù)。