陳?ài)が?呂夢(mèng)丹 張怡 張晗 郭燕君

（嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 嘉興 314001）

女性生殖衰老是由卵巢衰老引起的，出生時(shí)卵巢原始卵泡池中卵母細(xì)胞數(shù)量是女性未來(lái)生育能力和卵巢內(nèi)分泌功能的關(guān)鍵決定因素。雌性哺乳動(dòng)物生殖的基本功能單位是卵泡，而原始卵泡則是卵泡發(fā)育的起點(diǎn)。

在大多數(shù)哺乳動(dòng)物物種中，原始卵泡的形成與數(shù)量決定發(fā)生在出生前或新生階段。如果原始卵泡供應(yīng)過(guò)早枯竭，出生后也不可能制造新的原始卵泡[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在化療藥物的作用下，原始卵泡由于其基因組完整性受到破壞而大量減少。這可能是由于化療藥物通過(guò) PI3K/AKT/FOXO3a信號(hào)通路加速了原始卵泡的激活和成熟，最終耗盡原始卵泡的卵巢儲(chǔ)備[2]。這也是導(dǎo)致卵巢早衰和不孕的可能原因。顆粒細(xì)胞可為卵母細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和促成熟調(diào)節(jié)因子，保證卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中它能通過(guò)自身的抗氧化系統(tǒng)保護(hù)卵母細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[3-4]。顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡內(nèi)的一種生理現(xiàn)象，可引起卵泡閉鎖及卵泡數(shù)量減少[5]。因此，卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡是導(dǎo)致卵巢早衰的主要病因之一。

PUMA是 2001年發(fā)現(xiàn)的一種促凋亡基因，其編碼蛋白是一種僅含一個(gè)BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2相關(guān)蛋白家族蛋白[6]，也稱為BBC3（Bcl-2 binding component3），因其可以被p53快速誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄及其編碼的蛋白具有強(qiáng)大促凋亡作用而得名[7]。PUMA的主要生理功能是誘導(dǎo)受損或應(yīng)激的細(xì)胞凋亡，參與調(diào)節(jié)卵巢衰老生理過(guò)程。本文綜述PUMA的生物學(xué)活性和調(diào)控卵巢衰老的機(jī)制。為延長(zhǎng)生殖壽命和提高生育能力奠定基礎(chǔ)。

1 PUMA的結(jié)構(gòu)與功能

PUMA基因（19q13.3）導(dǎo)致促凋亡BH3蛋白的表達(dá)。PUMA轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度約為1.6～1.9 kb，PUMA基因具有4個(gè)外顯子和三個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后形成四種不同的剪接體（PUMA-α、PUMA -β、PUMA -γ及PUMA -δ），只有含有BH3結(jié)構(gòu)域的PUMA α和PUMA β顯示促凋亡活性。它們可以與線粒體膜中的 Bcl-2家族成員相互作用，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞色素C從線粒體重新定位到細(xì)胞質(zhì)中。除了含有BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)外，PUMA與其他已知蛋白質(zhì)沒(méi)有顯著的同源性。人和小鼠PUMA序列的比對(duì)表明約90%的同一性[8-10]。

PUMA位于線粒體外膜，通過(guò)直接或間接抑制抗凋亡 Bcl-2家族成員而啟動(dòng)凋亡，這種相互作用減輕了線粒體膜對(duì)促凋亡Bax/Bak基因的抑制作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，凋亡小體形成，Caspase激活以及隨后的細(xì)胞破壞。PUMA介導(dǎo)由細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。還驅(qū)動(dòng)由p53非依賴性信號(hào)誘導(dǎo)的凋亡，如生長(zhǎng)因子剝奪或暴露于糖皮質(zhì)激素或佛波酯。

2 PUMA調(diào)控卵巢衰老的機(jī)制

2.1 調(diào)節(jié)小鼠生殖細(xì)胞丟失和原始卵泡發(fā)育

最初在卵巢內(nèi)建立的原始卵泡的數(shù)量受胚胎卵巢發(fā)育過(guò)程中生殖細(xì)胞死亡程度的影響，但機(jī)制尚未完全揭示。Myers等人研究發(fā)現(xiàn)，PUMA是卵巢發(fā)育過(guò)程中決定生殖細(xì)胞數(shù)量的關(guān)鍵決定因素[11]。早在胚胎第13.5天，Puma基因的靶向敲除就顯示出生殖細(xì)胞數(shù)量的顯著增加。在之后的胚胎階段和出生后早期，Puma-/-雌性小鼠的生殖細(xì)胞數(shù)量與WT雌性小鼠相比保持升高，出生后第 10天卵巢中原始卵泡數(shù)量增加 1.9倍。但在Puma-/-雌性的卵巢中觀察到的生殖細(xì)胞數(shù)量的增加并非由于卵巢中生殖細(xì)胞增殖活性的改變。研究還顯示 PUMA是生殖細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在卵子發(fā)生的遷移階段或生殖細(xì)胞到達(dá)性腺后不久起作用，PUMA介導(dǎo)的細(xì)胞死亡限制了最初卵巢儲(chǔ)備中建立的原始卵泡的數(shù)量[11]。因此PUMA基因的缺失可保護(hù)卵巢儲(chǔ)備，并保持生育能力。但PUMA基因的缺失不會(huì)影響到生殖細(xì)胞巢破裂時(shí)大量生殖細(xì)胞丟失的發(fā)生。

2.2 調(diào)控卵泡閉鎖

顆粒細(xì)胞凋亡是卵泡閉鎖的潛在機(jī)制之一?；钚匝酰≧eactive oxygen species，ROS）在卵泡發(fā)育和存活中起重要作用。檸檬酸循環(huán)中形成的副產(chǎn)物ROS可能通過(guò)與細(xì)胞中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸相互作用而引起氧化損傷。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)氧化和還原過(guò)程之間的平衡被破壞，并且細(xì)胞無(wú)法修復(fù)由此產(chǎn)生的氧化損傷時(shí)，增加的ROS會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激[12]。與年齡相關(guān)的卵母細(xì)胞質(zhì)量和生育能力下降都是由氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的[13]，且氧化應(yīng)激也促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡[14]。顆粒細(xì)胞對(duì)活性氧敏感。盡管內(nèi)源性H2O2是重要的信號(hào)分子，但高水平的H2O2可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡，含H2O2的ROS在顆粒細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。

研究表明 H2O2可以誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[15]，包括降低抗凋亡分子（如 Bcl-2，Bcl-xL和Mcl-1）的表達(dá)，以及增加促凋亡因子（如 Bax，Bak和PUMA）的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明過(guò)表達(dá)puma可加強(qiáng)H2O2誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡，而敲除puma基因會(huì)顯著降低了這種細(xì)胞凋亡，由此確認(rèn)PUMA是顆粒細(xì)胞凋亡的參與者。由于PUMA直接誘導(dǎo)Bax和Bak的逐步激活，故PUMA上調(diào)會(huì)導(dǎo)致顆粒細(xì)胞凋亡。另一方面，過(guò)表達(dá)的Bcl-xL可抑制H2O2誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡[28]。此外，Bax和Bak的自主活化可以獨(dú)立于激活劑BH3s，下調(diào)Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1[29]。因此，H2O2誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡機(jī)制是由于 Bax和 Bak的激活，通過(guò)增加PUMA和減少抗凋亡因子Bcl-2、Bcl-xL和Mcl-1來(lái)介導(dǎo)的。這些結(jié)果均提示抑制PUMA可能提高顆粒細(xì)胞的存活率，對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)的卵泡閉鎖有有益的作用。

2.3 誘導(dǎo) DNA損傷原始卵泡卵母細(xì)胞凋亡和生育力喪失

研究發(fā)現(xiàn)PUMA和NOXA對(duì)DNA損傷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白63（Transformation-related protein 63，Trp63）介導(dǎo)的原始卵泡卵母細(xì)胞凋亡至關(guān)重要。Trp63是一種與腫瘤抑制因子 p53相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于原始卵泡卵母細(xì)胞細(xì)胞核中主要的Trp53家族成員，對(duì)體內(nèi)DNA損傷引發(fā)的細(xì)胞凋亡至關(guān)重要。γ射線照射后，在成年野生型和Trp53-/-小鼠的原始卵泡卵母細(xì)胞中只觀察到促凋亡成員Puma和Noxa的誘導(dǎo)，而在Trp63缺陷小鼠中未觀察到Puma和Noxa的誘導(dǎo)。Puma缺陷或Puma和Noxa缺陷的小鼠的原始卵泡卵母細(xì)胞被保護(hù)免受γ射線輻射誘導(dǎo)的凋亡，并且可以產(chǎn)生健康的后代[16]。DNA損傷誘導(dǎo)Trp63介導(dǎo)的原始卵泡卵母細(xì)胞凋亡機(jī)制總結(jié)如圖1所示。

圖1 DNA損傷誘導(dǎo)Trp63介導(dǎo)的原始卵泡卵母細(xì)胞凋亡機(jī)制

誘導(dǎo)凋亡的DNA損傷導(dǎo)致Trp63的激活，PUMA和NOXA的直接的或間接的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，隨后PUMA和NOXA蛋白與促存活的BCL-2家族成員（BCL-2、BCLXL、BCL-W、MCL-1）結(jié)合，也可能是 PUMA與 BAX/BAK的直接結(jié)合激活BAX和BAK，導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡。

2.4 PUMA缺失可保護(hù)卵巢儲(chǔ)備免受化療藥物的損傷

Quynh等人使用基因缺失小鼠模型來(lái)研究DNA損傷誘導(dǎo)的促凋亡蛋白PUMA及其轉(zhuǎn)錄激活因子Trp63在環(huán)磷酰胺或順鉑治療引起的原始卵泡衰竭中的作用[17]。環(huán)磷酰胺幾乎完全破壞了成年野生型小鼠的原始卵泡池，順鉑也被觀察到了顯著的破壞作用。與此形成鮮明對(duì)比的是，Puma-/-小鼠在任何一種基因毒性治療后都保留了100%的原始卵泡。

此外，僅敲除PUMA就完全保持了環(huán)磷酰胺處理小鼠的生育能力，研究表明從 DNA損傷誘導(dǎo)的死亡中拯救出來(lái)的卵母細(xì)胞可以自我修復(fù)，足以支持生殖功能和后代健康。順鉑治療后Trp63-/-小鼠的原始卵泡也得到保護(hù)，但環(huán)磷酰胺治療后 Trp63-/-小鼠的原始卵泡沒(méi)有得到保護(hù)。PUMA轉(zhuǎn)錄激活的途徑可能不同，順鉑激活Trp63依賴的過(guò)程，而環(huán)磷酰胺通過(guò)Trp63非依賴的途徑起作用。研究表明不同化療藥物誘導(dǎo)的DNA損傷中，誘導(dǎo)凋亡和卵巢儲(chǔ)備減少的機(jī)制不同，PUMA是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)物，PUMA導(dǎo)致暴露于環(huán)磷酰胺或順鉑后原始卵泡的衰竭，抑制PUMA可能是婦女癌癥治療期間有效的卵巢保護(hù)策略。環(huán)磷酰胺和順鉑誘導(dǎo) DNA損傷而導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡的分子途徑總結(jié)如圖2所示。

圖2 環(huán)磷酰胺和順鉑誘導(dǎo)DNA損傷后卵母細(xì)胞凋亡的途徑

順鉑引起的DNA損傷激活了一條信號(hào)通路，其中Trp63起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，下游轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)Puma，最終導(dǎo)致凋亡效應(yīng)物BAX和BAK的釋放。環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的 DNA損傷激活了一種不需要Trp63的替代信號(hào)通路；可能的介質(zhì)是FOXO3a或p53。實(shí)心箭頭表示已知路徑。虛線箭頭表示可能的替代路徑。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，PUMA是卵巢發(fā)育過(guò)程中生殖細(xì)胞數(shù)量和原始卵泡發(fā)育的關(guān)鍵決定因素，抑制PUMA可能通過(guò)提高顆粒細(xì)胞的存活率來(lái)減少卵泡閉鎖，PUMA是Trp63誘導(dǎo)的原始卵泡凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)物。然而，PUMA與生殖細(xì)胞數(shù)量、原始卵泡的發(fā)育和顆粒細(xì)胞凋亡三個(gè)方面的機(jī)制尚未清楚，仍有待進(jìn)一步研究。特別是卵巢癌化療方面，破壞 DNA的癌癥化療治療會(huì)耗盡原始卵泡的卵巢儲(chǔ)備，導(dǎo)致卵巢早衰和不孕。進(jìn)一步探索 PUMA在卵巢癌化療驅(qū)動(dòng)的卵泡丟失的確切機(jī)制將有利于促進(jìn)靶向卵巢保護(hù)劑的發(fā)展。在癌癥治療期間通過(guò)阻斷Puma來(lái)保護(hù)女性生育能力，對(duì)于防止過(guò)早絕經(jīng)、改善女性健康、和為人類生殖臨床提供理論基礎(chǔ)方面將有著積極的意義。