潘瓊 谷見(jiàn)法 劉松格 楊曉瑞

（鄭州市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450007）

目前胃癌的主要治療方式為手術(shù)切除，早期胃癌患者術(shù)后5年生存率可達(dá)90%以上，但因胃癌早期臨床癥狀不明顯，多數(shù)胃癌患者在確診時(shí)已處于中晚期，治療效果不盡人意[1]?；罨准?xì)胞黏附因子（Activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM），即CD166是免疫球蛋白超家族成員之一，廣泛存在于各組織器官，通過(guò)黏附作用介導(dǎo)細(xì)胞間的相互作用，參與多種生理過(guò)程以及腫瘤發(fā)生發(fā)展[2-3]。研究顯示 CD166在胃癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)[4]，但如何影響胃癌的發(fā)生尚不清楚。

故本文探討CD166對(duì)AZ-521胃癌細(xì)胞系增殖能力的影響，以期為進(jìn)一步探討其參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制提供初步的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

裸鼠（6-8 w）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生物有限公司；2×SYBR Green qPCR Mix購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；兔抗人CD166兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；β-actin單克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自北京中山金橋生物有限公司；CCK-8試劑盒檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞株 AZ-521購(gòu)自南京科佰生物科技有限公司，接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃，5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)并傳代。

1.3 慢病毒包裝

pLOX-CWBmi1-CD166慢病毒質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建。將pLOX- WBmi1（15 μg）慢病毒空載體與pLOX-CWBmi1-CD166（15 μg）慢病毒重組載體分別與輔助質(zhì)粒psPA X2（9.6 μg）和 Pmd2.G（5.4 μg）加入 600 μL pti-MEM中，取20 μL lipofectamine 200加入另一管600 μL Opti-MEM中混勻，靜置5 min，兩管Opti-MEM混合，室溫孵育20 min，轉(zhuǎn)染6 h后換液。48 h后加Puromycin（1 g·kg-1）篩選陽(yáng)性細(xì)胞，同時(shí)設(shè)等密度對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行篩選。待對(duì)照 AZ-521細(xì)胞全部死亡后，感染細(xì)胞采用胰酶消化，并進(jìn)行稀釋、克隆，待單克隆形成后，采用熒光定量PCR和Western blot進(jìn)行測(cè)定。

1.4 熒光定量PCR測(cè)定CD166 mRNA表達(dá)水平

根據(jù) CD166的 mRNA序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR 引物，CD166-F：5’-GATCTCCGCCACCGTCTTCA G-3’；CD166-R: 5’-CGTCGTACTGC ACACT TTTC-5’。合成的引物稀釋為10 nM。收集對(duì)照細(xì)胞和CD166過(guò)表達(dá)細(xì)胞，采用RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后按照下列體積建立 PCR 體系：2×SybGreen mix 10 μL, CD166-F/R 各 0.6 μL，cDNA 8.8 μL，總體積 20 μL。根據(jù)需要配置合適的體系，加入熒光定量PCR板中，在下述反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，循環(huán)數(shù)40次，PCR結(jié)束后建立溶解曲線，分析兩組mRNA水平。

1.5 Western blot分析CD166蛋白水平

收集對(duì)照細(xì)胞和CD166過(guò)表達(dá)細(xì)胞，加入1×上樣緩沖液，沸水煮20 min，將樣本測(cè)蛋白濃度后，取50 μg總蛋白上樣電泳，取出凝膠切取目的條帶，用蒸餾水沖洗，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉30 min后，用CD166兔多克隆抗體在 4℃孵育過(guò)夜，次日用PBST洗滌 3次，每次 5 min，結(jié)束后用羊抗兔HRP標(biāo)記的抗體在室溫孵育1 h，結(jié)束后PBST洗滌3次，每次5 min，然后顯影觀察CD166蛋白表達(dá)情況。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

分別將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 AZ-521對(duì)照細(xì)胞和CD166過(guò)表達(dá)細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，接種于96 孔板中（8×103個(gè)·mL-1，每孔 100 μL），分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24和48 h。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后測(cè)定450 nm處吸光值。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.7 克隆形成測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 AZ-521對(duì)照細(xì)胞和CD166過(guò)表達(dá)細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，分別取100個(gè)克隆接種于6孔板中，放置37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d更換一次培養(yǎng)基。至第12 d時(shí)細(xì)胞克隆基本形成。棄培養(yǎng)基，經(jīng)PBS洗滌后，室溫下甲醇固定10 min，清洗、風(fēng)干后加入結(jié)晶紫染色液染色20 min。計(jì)數(shù)每皿細(xì)胞中50個(gè)細(xì)胞以上的克隆數(shù)目，每種細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.8 動(dòng)物腫瘤模型建立

將46只BALB/c雄性裸鼠（18～23 g）隨機(jī)分為對(duì)照組和CD166組（n=23），持續(xù)通過(guò)3.0%異氟烷氣體和30%氧氣混合進(jìn)行吸入麻醉誘導(dǎo)后，均于小鼠左側(cè)腋下分別接種對(duì)照細(xì)胞、CD166過(guò)表達(dá)細(xì)胞，每日觀察并統(tǒng)計(jì)小鼠的成瘤狀況、腫瘤體積以及存活時(shí)間，連續(xù)統(tǒng)計(jì)30 d。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）的形式表示，組間樣本比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）來(lái)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示樣本間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)表達(dá)CD166胃癌AZ-521細(xì)胞株構(gòu)建

pLOX-CWBmi1-CD166慢病毒質(zhì)粒感染后，AZ-521細(xì)胞中CD166蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 Western Blot測(cè)定CD166蛋白水平

2.2 過(guò)表達(dá)CD166對(duì)胃癌AZ-521細(xì)胞增殖的影響

經(jīng)慢病毒感染胃癌AZ-521細(xì)胞12 h、24 h、48 h后，細(xì)胞數(shù)量均明顯增加 (P＜0.05)，但過(guò)表達(dá)CD166胃癌AZ-521細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的增殖活力均明顯高于對(duì)照組細(xì)胞 (P＜0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 CCK-8測(cè)定細(xì)胞增殖能力

2.3 吉姆薩染色檢測(cè)CD166過(guò)表達(dá)細(xì)胞克隆形成

與對(duì)照組細(xì)胞克隆形成數(shù)比較，CD166過(guò)表達(dá)細(xì)胞的克隆形成數(shù)明顯升高 (P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 細(xì)胞克隆形成

2.4 動(dòng)物模型成瘤情況

腫瘤建模對(duì)照組小鼠死亡率為4.35%，CD166組小鼠死亡率為8.70%，均建模成功，見(jiàn)表1。CD166組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯快于對(duì)照細(xì)胞系 (P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 小鼠腫瘤體積測(cè)定

表1 兩組小鼠死亡、存活情況對(duì)比（例（%），n=23）

3 討論

CD166屬于免疫球蛋白家族中的單鏈跨膜糖蛋白，是淋巴細(xì)胞抗原CD6的配體，廣泛分布于活化的白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、神經(jīng)元、造血干細(xì)胞、間葉組織干細(xì)胞等多種細(xì)胞中，參與機(jī)體的細(xì)胞黏附、造血、炎癥以及系統(tǒng)發(fā)育等多種生物學(xué)過(guò)程[5]。近年研究顯示，CD166參與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移具有調(diào)控作用[6-7]。目前發(fā)現(xiàn)，CD166在惡性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌以及乳腺癌中呈高表達(dá)狀態(tài)，并與腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)侵襲密切相關(guān)[8-9]，但尚未見(jiàn)胃癌組織中 CD166蛋白的研究。

本文研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達(dá)CD166蛋白的AZ-521細(xì)胞的增殖速度明顯增加，細(xì)胞形成克隆率更高，在動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)中，CD166組小鼠成瘤體積顯著大于對(duì)照組小鼠同期的腫瘤體積，這表明過(guò)表達(dá) CD166與腫瘤細(xì)胞的增殖存在密切的關(guān)系。這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，即CD166表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞，在前列腺癌、乳腺癌、食管癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著積極的作用，并與多種臨床病理指標(biāo)及預(yù)后相關(guān)[10]。

已有研究證明 CD166可能是通過(guò)以下途徑促進(jìn)腫瘤發(fā)生和浸潤(rùn)侵襲的：CD166可促進(jìn)前體MMP（基質(zhì)金屬蛋白酶）-2向活化MMP-2的轉(zhuǎn)變，而 MMP-2在細(xì)胞外基質(zhì)和基底的降解中起著重要作用，細(xì)胞外基質(zhì)的加速降解又促進(jìn)了腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[11]。但也有研究表明在某些腫瘤中CD166表達(dá)下調(diào)，可降低細(xì)胞的黏附能力以及能動(dòng)性，從而促進(jìn)腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12]。因此CD166在不同腫瘤發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色仍需進(jìn)一步的研究和探索。

綜上所述，CD166高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖活力及生長(zhǎng)速度，并顯著加速胃癌腫瘤的發(fā)生進(jìn)程。這可能為未來(lái)胃癌腫瘤的早期鑒定、治療及預(yù)后提供一定的參考價(jià)值。