戴佳旺， 王會停， 崔施施， 方 元， 徐宏濤， 賴文昶，楊 晨， 李小芳， 李新安， HAFIZA Javaria Ashraf， 王聯(lián)德*

(1.福建農(nóng)林大學(xué)閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點(diǎn)實驗室， 福建福州350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實驗室， 福建福州350002)

柑橘木虱(Diaphorina citriKuwayama)，屬半翅目(Hemiptera)，木虱科(Psyllide)，為刺吸式口器害蟲，成蟲和若蟲以吸食植物韌皮部汁液直接危害寄主，是柑橘等蕓香科植物上的重要害蟲。 該蟲直接取食柑橘嫩芽、幼葉等部位，造成柑橘幼葉片畸形、干枯脫落等，若蟲分泌的蜜露還易引發(fā)煤污病(黃建等，1999)。 除直接取食柑橘等蕓香科植物造成重大損失外，柑橘木虱還是毀滅性病害柑橘黃龍病的重要傳播媒介(Hodkinsonet al，1981)。

目前對柑橘木虱的防治多采用化學(xué)防治，但同時也帶來了諸多負(fù)面問題，而生物農(nóng)藥以其高效、低毒、低殘留、無污染、不易產(chǎn)生抗藥性等特性已逐漸引起人們的重視。 球孢白僵菌[Beauveria bassiana(Balsamo)]是一種常見的寄生型蟲生真菌，具有寄主范圍廣、致病性與適應(yīng)力強(qiáng)等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各類農(nóng)林類害蟲的防治(Greenfieldet al，2016；Heskethet al，2010)。

柑橘木虱體內(nèi)含有多種內(nèi)共生菌(包括初生內(nèi)共生菌Carsonella，以及次生內(nèi)共生菌Wolbachia和Mycetocyte等)，這些內(nèi)共生菌大多分布在柑橘木虱的腸道內(nèi)，在柑橘木虱的生長發(fā)育、環(huán)境適應(yīng)性和免疫性等中發(fā)揮重要作用(馬曉芳等，2012)。 徐紅星等(2009)發(fā)現(xiàn)，柑橘木虱內(nèi)共生菌可以幫助其抵御寄生蜂的侵染。 Dossiet al(2014)發(fā)現(xiàn)柑橘木虱體內(nèi)Wolbachia的含量會隨其蟲齡增長而增多，這說明Wolbachia可能在柑橘木虱的生長發(fā)育中起到持續(xù)的作用。

亞致死效應(yīng)是指噴施殺蟲劑或者蟲生真菌后昆蟲個體受到一定的毒害卻并未致死仍有一定行為能力的現(xiàn)象(Desneuxet al，2007；宋亮，2013)。 有研究表明，蟲生真菌對害蟲的亞致死效應(yīng)會影響昆蟲的生殖及發(fā)育，如球孢白僵菌NJBb2101 菌株亞致死濃度(LC20)使褐飛虱F0和F1代的卵、若蟲和成蟲的發(fā)育歷期延長，卵孵化率、若蟲和成蟲的存活率降低，雌性比率以及單雌產(chǎn)卵量下降等(Wanget al，2018)。

蟲生真菌亞致死劑量會影響昆蟲的生殖及發(fā)育，而昆蟲內(nèi)共生菌同樣參與了宿主的生殖發(fā)育，為了明確蟲生真菌亞致死劑量對昆蟲內(nèi)共生菌的影響，本研究采用熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)，檢測了球孢白僵菌2 個菌株亞致死濃度處理后，柑橘木虱F1代成蟲腸道中內(nèi)共生菌Wolbachia、Carsonella的變化，研究結(jié)果對探明柑橘木虱-內(nèi)共生菌-蟲生真菌三者間的互作具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器試劑 人工氣候箱(DGX-330E，寧波賽福試驗儀器有限公司)，高壓滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，體視顯微鏡(奧特光學(xué)SZ680)，生物顯微鏡(奧林巴斯CX23)，激光共聚焦顯微鏡(LeicaSP8)，46.0 g·L-1馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato sucrose agar)培養(yǎng)基(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)，80 mm×120 mm PET 養(yǎng)蟲罩(自制)，10 mL 噴壺，50 mL 離心管(市場購買)。

熒光原位雜交試驗所需試劑配置如下，0.5 mL 洗滌緩沖液A:400 μL ddH2O＋100 μL SSC 20×＋1 μL 0.1% Tween 20；0.5 mL 洗滌緩沖液 B:450 μL ddH2O＋50 μL SSC 20×；0.5 mL 洗滌緩沖液 C:475 μL ddH2O＋25 μL SSC 20×；1 mL 預(yù)雜交緩沖液:800 μL ddH2O＋200 μL SSC 20×＋0.03 g 牛血清蛋白；1 mL 雜交緩沖液:800 μL ddH2O＋200 μL SSC 20×＋1 μL probe。

1.1.2 供試蟲源 柑橘木虱采集于福建農(nóng)林大學(xué)閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點(diǎn)實驗樓前，采集后在實驗室飼養(yǎng)3 代以上。 寄主植物為九里香，購買同一批次株高約10 ～15 cm 九里香，將其移栽至小花盆中，定植后用于柑橘木虱飼養(yǎng)。 人工氣候箱條件為:溫度(28±1)℃，相對濕度(70±10)%，光周期 L ∶D＝14 ∶10。

1.1.3 供試菌株 球孢白僵菌FAFU-12(GenBank ID:MG844429)和 FAFU-16(GenBank ID:MG844431)菌株來自于福建農(nóng)林大學(xué)閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點(diǎn)實驗室，供試菌株于4 ℃保存，PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)球孢白僵菌，培養(yǎng)溫度(25±1) ℃。

1.2 球孢白僵菌亞致死濃度篩選

1.2.1 球孢白僵菌孢子懸浮液制備 將在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 d，長勢良好的FAFU-12 和FAFU-16 菌株用無菌刀刮下，采用Bamisileet al(2019)所用方法配置1×108conidia·mL-1濃度的孢子懸浮液，而后用 1%的吐溫-80 無菌水溶液分別稀釋到 1×104、1×105、1×106、1×107conidia·mL-1，共 5 個濃度備用。

1.2.2 球孢白僵菌對柑橘木虱致病力的測定 挑選孵化10 d 左右的柑橘木虱成蟲，接至九里香植株上，每株20 頭，用錫箔紙覆蓋花盆土壤，便于查看試蟲的死亡蟲體，隨后罩上養(yǎng)蟲罩，將配制好的不同濃度梯度的球孢白僵菌孢子懸浮液分別噴施到帶蟲的九里香植株上，每盆植物噴施約10 mL，對照組用1%吐溫-80 無菌水溶液進(jìn)行處理。 每個菌株設(shè)5 個濃度，每個濃度設(shè)6 個重復(fù)。 噴施完畢后將處理過的九里香放入人工氣候箱中，飼養(yǎng)條件同上。 從次日開始觀察，連續(xù)觀察7 d，每天記錄處理組和對照組中的活蟲數(shù)。 收集死亡后的柑橘木虱蟲體，將其置于鋪有2 層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，觀察是否有對應(yīng)蟲生真菌的菌絲生長，確保柑橘木虱死亡是由球孢白僵菌所致。

用Excel 2010 軟件初步整理試驗數(shù)據(jù)，IBM SPSS Statistics 21 軟件統(tǒng)計分析，使用單因素方差分析對校正死亡率進(jìn)行差異性比較，計算亞致死濃度(LC25)、致死中濃度(LC50)和致死中時間(LT50)。

1.3 熒光原位雜交處理

1.3.1 設(shè)計熒光探針 根據(jù)柑橘木虱內(nèi)共生菌Wolbachia、Carsonella在NCBI 的16S rRNA 序列設(shè)計特異性引物，并以Cy5 熒光染料修飾引物的5′，其體內(nèi)2 種內(nèi)共生菌的引物序列及熒光染料位點(diǎn)如表1 所示，激發(fā)波長為646～662 nm，在激發(fā)波長的范圍內(nèi)發(fā)出紅光。

表1 柑橘木虱2 種內(nèi)共生菌的引物序列及熒光染料位點(diǎn)Table 1 Primer sequences and fluorescent dye sites of the three endosymbionts of D. citri

1.3.2 球孢白僵菌亞致死劑量處理 根據(jù)得出的亞致死濃度(LC25)，配置2 菌株孢子懸浮液備用。 挑選羽化后10 d 左右的柑橘木虱成蟲，接至已準(zhǔn)備好的具有嫩梢的九里香上，每盆植物噴施10 mL 蟲生真菌亞致死濃度菌液。 每個處理設(shè)6 個重復(fù)，每個重復(fù)40 頭，噴施完成后置于人工氣候箱中飼養(yǎng)。 處理7 d 后挑出每個處理中存活的柑橘木虱，將其轉(zhuǎn)移到新的九里香植株上，置于人工氣候箱中飼養(yǎng)，在顯微鏡下觀察柑橘木虱產(chǎn)卵情況，24 h 后移除成蟲，定期管理直至卵發(fā)育為成蟲。

1.3.3 柑橘木虱腸道解剖及熒光原位雜交處理 從各處理的柑橘木虱F1代成蟲中挑選羽化后10 d 左右的成蟲90 頭，將試蟲用75%的酒精浸泡處理1 min，再用無菌水進(jìn)行清洗，而后將試蟲置于含有磷酸鹽緩沖液的培養(yǎng)皿中進(jìn)行解剖，將解剖出完整的柑橘木虱腸道置于含200 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)的離心管中，放置2 h 之后進(jìn)行下一步處理。 將試蟲腸道用PBS漂洗3 次(每次500 μL)，漂洗后放入100 ℃的恒溫水浴鍋中加熱15 min，加熱結(jié)束后再使用PBS 漂洗各管中樣品3 次，吸去多余的PBS 溶液，并向離心管中加入20 μL 預(yù)雜交緩沖液，隨后將其放入37 ℃的干式恒溫器中預(yù)雜交20 min。 而后將試蟲腸道放入含1 mL 雜交緩沖液的離心管(2 mL)中，在避光的環(huán)境下分別加入對應(yīng)的雜交探針，使用錫箔紙包住各管并放入37 ℃干式恒溫器中預(yù)雜交1 h 以上，雜交結(jié)束后取出樣本，在避光條件下分別使用洗滌緩沖液A、B、C 漂洗樣本(每次每管500 mL)。 玻片制作，用一滴甘油將樣本固定在載玻片上，在顯微鏡下調(diào)整好樣本的形狀后，蓋上蓋玻片。 最后，使用激光共聚焦顯微鏡觀察樣本并保存照片。

1.3.4 分析方法 參考Mannet al(2018)方法將柑橘木虱的腸道劃分為過濾腔、中腸、馬氏管和后腸4 個部分，根據(jù)試驗結(jié)果所得圖片對處理組和對照組2 種內(nèi)共生菌變化進(jìn)行分析，2 種內(nèi)共生菌(Wolbachia、Carsonella)均以紅色熒光形式顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 球孢白僵菌對柑橘木虱亞致死濃度的篩選

噴施球孢白僵菌 2 菌株 7 d 后，F(xiàn)AFU-12 菌株 5 個濃度(1×104～1×108conidia/mL)均顯著降低了柑橘木虱的存活率(F5，18＝ 132.65 ，P＝0.000 1)；FAFU-16 菌株除 1×104conidia·mL-1濃度外，其余濃度也均顯著降低了柑橘木虱的存活率(F5，18＝ 76.63 ，P＝ 0.000 1)(表 2)。 2 個菌株對柑橘木虱的致病力隨濃度的升高而增加，隨噴施時間延長死亡率不斷上升，噴施濃度為1×108conidia·mL-1時死亡率最高，死亡率分別為87.15%和83.18%。 球孢白僵菌2 菌株對柑橘木虱的致死中時間(LT50)分別為3.23 和4.04 d，F(xiàn)AFU-12 菌株LT50相對較短(表3)。 由致病力參數(shù)計算得出，噴施7 d 后球孢白僵菌 FAFU-12 和FAFU-16 菌株的亞致死濃度(LC25)分別為 1.60 × 104和 4.89 × 104conidia·mL-1， 致 死 中 濃 度 (LC50) 分 別 為 7.46 × 105和21.10×105conidia·mL-1(表4)，這說明 FAFU-12 菌株致病力大于 FAFU-16 菌株。

表2 球孢白僵菌對柑橘木虱的校正死亡率Table 2 Corrected mortality of B. bassiana against D. citri

表3 球孢白僵菌(1×108 conidia·mL-1)對柑橘木虱的致死中時間Table 3 The median lethal time of B. bassiana (1×108 conidia·mL-1) against D. citri

表4 球孢白僵菌對柑橘木虱的亞致死濃度和致死中濃度Table 4 Sublethal and median lethal concentrations of B. bassiana against D. citri

2.2 球孢白僵菌亞致死濃度對柑橘木虱腸道中Wolbachia 的影響

對照組(CK)F1代柑橘木虱腸道內(nèi)Wolbachia主要分布于馬氏管、中腸、過濾腔和后腸，且紅色熒光強(qiáng)度較高，表明其分布廣泛，含量較高，明場通道紅色熒光分布范圍與熒光通道的結(jié)果相對應(yīng)，表明試驗結(jié)果真實可信(圖1)。 與對照組相比，F(xiàn)AFU-12 菌株的亞致死濃度處理后，F(xiàn)1代柑橘木虱腸道內(nèi)Wolbachia主要分布在馬氏管和中腸處的熒光強(qiáng)度顯著減弱，表明紅色熒光分布范圍減少；FAFU-16 菌株的亞致死濃度處理后，中腸的熒光強(qiáng)度減弱了。 可見這2株菌株的亞致死濃度均可影響F1代柑橘木虱腸道內(nèi)的Wolbachia，且FAFU-12 菌株的亞致死濃度對F1代柑橘木虱腸道內(nèi)Wolbachia的影響大于FAFU-16 菌株。

圖1 球孢白僵菌亞致死濃度處理柑橘木虱后F1 代腸道內(nèi)Wolbachia 的分布Figure 1 The distribution of Wolbachia in the intestines of the F1 generation after the treatment of D. citri by B. bassiana LC25

2.3 球孢白僵菌亞致死濃度對柑橘木虱腸道中Carsonella 的影響

對照組(CK)F1代柑橘木虱腸道內(nèi)Carsonella主要分布于中腸、后腸和馬氏管，明場通道結(jié)果與相應(yīng)的熒光通道結(jié)果一致，表明試驗結(jié)果真實可信(圖2)。 與對照組相比，F(xiàn)AFU-12 菌株亞致死濃度處理后，柑橘木虱F1代腸道內(nèi)Carsonella主要分布在中腸、后腸和過濾腔，馬氏管中未檢測到紅色熒光；FAFU-16 菌株亞致死濃度處理后， F1代柑橘木虱腸道內(nèi)Carsonella主要分布于中腸、后腸和過濾腔，與對照組相比，Carsonella分布發(fā)生了變化。

圖2 球孢白僵菌亞致死濃度處理柑橘木虱后F1 代腸道內(nèi)Carsonella 的分布Figure 2 The distribution of Carsonella in the intestines of the F1 generation after the treatment of D. citri by B. bassiana LC25

3 結(jié)論與討論

本研究采用生物測定法測定了球孢白僵菌 FAFU-12 和FAFU-16 菌株對柑橘木虱的致病力，包括校正死亡率、LC25、LC50、LT50以及各個菌株的時間-濃度-死亡率曲線，為蟲生真菌對柑橘木虱的生物防控提供了理論依據(jù)。

采用FISH 技術(shù)檢測了球孢白僵菌的亞致死濃度對F1代柑橘木虱成蟲腸道內(nèi)Wolbachia、Carsonella的影響。 在對照組中，Wolbachia在F1代柑橘木虱腸道內(nèi)分布廣泛，主要包括馬氏管、中腸、過濾腔和后腸，且熒光強(qiáng)度較高，這一觀察結(jié)果與Mannet al(2018)和馬曉芳等(2012)研究結(jié)果一致；Carsonella主要分布在F1代柑橘木虱腸道內(nèi)的中腸、后腸和馬氏管中。球孢白僵菌2 個菌株亞致死濃度處理后，Wolbachia的分布區(qū)域明顯減少，熒光信號強(qiáng)度減弱；腸道中Carsonella的分布區(qū)域雖然變化不大，但熒光信號強(qiáng)度明顯減弱。 這些結(jié)果表明球孢白僵菌亞致死濃度對2 種內(nèi)共生菌均有影響，表現(xiàn)為減少了內(nèi)共生菌在腸道中的分布與含量，其中對Wolbachia的影響大于Carsonella，且與菌株的致病力呈負(fù)相關(guān)，即致病力越強(qiáng)內(nèi)共生菌分布越少、含量越低。

內(nèi)共生菌Wolbachia是迄今為止已知最為廣泛存在的胞內(nèi)的共生菌之一，大約有16%的昆蟲感染了這種細(xì)菌，參與昆蟲的多種重要功能，如為昆蟲宿主提供必要的營養(yǎng)，增強(qiáng)宿主昆蟲的適應(yīng)性和對 RNA 病毒的抵抗力等(Werrenet al，2008；Teixeiraet al，2008；Engelstdteret al，2009；Hosokawaet al，2010)。 在本研究中，當(dāng)使用蟲生真菌亞致死濃度進(jìn)行處理后， F1代柑橘木虱腸道內(nèi)2 種內(nèi)共生菌中Wolbachia分布和含量降低最為顯著，也證明了當(dāng)柑橘木虱受到外界侵染時，宿主體內(nèi)Wolbachia在這種應(yīng)急反應(yīng)中的作用；球孢白僵菌侵染柑橘木虱同樣顯著降低了寄主F1代腸道中Carsonella的含量。 中腸是昆蟲消化系統(tǒng)中非常重要的一環(huán)，可以幫助昆蟲消化食物和吸收營養(yǎng)，和人體胃的作用相似(王曉容，2000)，位于柑橘木虱腸道中的Carsonella，也具有為宿主合成生長發(fā)育所需營養(yǎng)物質(zhì)的功能(Douglas，1989；Meyeret al，2008)；當(dāng)蟲生真菌侵染柑橘木虱時，大量攝取寄主體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)和水分供菌絲生長繁殖，致使寄主代謝紊亂，最終導(dǎo)致寄主死亡(Gillespieet al，2000)。 以上結(jié)論表明，柑橘木虱F1代腸道內(nèi)Wolbachia、Carsonella均參與了蟲生真菌與宿主的互作。 蟲生真菌侵染柑橘木虱后，通過影柑橘木虱體內(nèi)的共生菌的含量和分布來消弱其免疫作用。 寄主體內(nèi)的共生菌能幫助寄主抵御外界病原微生物的侵染(Teixeiraet al，2008)，所以，內(nèi)共生菌在蟲生真菌-柑橘木虱的侵染和免疫的Army-race(軍備競賽)中起到一個幫助寄主抵御外界病原微生物侵染的作用。