湯木果，汪科成，趙存朝,2，陶亮,2，田洋,2,3

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.國家辣木加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，昆明 650201；3.云南省生物大數(shù)據(jù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201）

0 引言

核桃（Juglaus Regia L.）又名胡桃、羌桃、萬歲子，系胡桃科核桃屬植物，是世界四大干果之一[1]。核桃具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，含有20%～25%的優(yōu)質(zhì)蛋白[2]，8種必需氨基酸含量合理[3]，人體消化率可達(dá)87%[4]，并且還含有一些人體必需的多種維生素、微量元素和礦物質(zhì)[5]。核桃中不飽脂肪酸含量較高，尤其是油酸、亞油酸及亞麻酸含量較高[6]，若長期食用，不僅不會(huì)升高血糖，還能在一定程度下減少人體對膽固醇的吸收，三高人群也可放心食用[7]。云南作為我國核桃生產(chǎn)的第一大省，目前核桃種植面積為4230萬畝，產(chǎn)量為102萬t，產(chǎn)值已達(dá)305億元[8]，種植面積、產(chǎn)量和產(chǎn)值均居全國之首。近年來，核桃產(chǎn)量持續(xù)增長，但產(chǎn)品較單一，主要以干果為主，精深加工不足，市場消耗量低，嚴(yán)重制約核桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

傳統(tǒng)酸奶都是以動(dòng)物源（牛乳）為原料[9]，而植物基酸奶是以純植物基成分為原料，添加菌種，采用生物發(fā)酵工藝以“植物蛋白”替換“動(dòng)物蛋白”為原料制作的發(fā)酵乳[10]。核桃具有豐富的營養(yǎng)成分和保健作用，并含有優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，必需氨基酸含量合理且易消化，以植物基核桃為原料開發(fā)酸奶，不僅可以豐富核桃制品的產(chǎn)品種類，同時(shí)可滿足當(dāng)代人對于健康與營養(yǎng)新產(chǎn)品的需求。相較于傳統(tǒng)酸奶，植物基核桃酸奶具有高蛋白、低脂肪、無乳糖、不含膽固醇、更易消化、吸收和提高各種營養(yǎng)素的利用率，且適合各個(gè)年齡階段的人飲用。目前，國內(nèi)外已有利用植物蛋白進(jìn)行部分或完全替代乳蛋白制備酸奶的研究，但以核桃作為植物基酸奶原料的研究較少。本研究以核桃仁為主要原料研發(fā)一款質(zhì)地良好、口感最佳、味道醇香且營養(yǎng)豐富、健康的植物基酸奶，這不僅可以豐富核桃產(chǎn)品品類，也可為云南核桃產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和精深加工奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫皮核桃仁，大理百里園生態(tài)食品發(fā)展有限公司；低聚果糖粉，鄭州化工原料有限公司；增稠劑（HBT-A3168、HBT-A1402、HBT-A5370），江蘇豪蓓特食品化學(xué)有限公司；植物淡奶油，青島雀巢食品有限公司；鼠李糖乳桿菌，實(shí)驗(yàn)室自凍干直投式菌種；乳酸菌k T-A8、土耳其菌種、乳酸菌CHN-22、乳酸菌1821DSL，北京正洺嘉科科貿(mào)有限公司；Mild 1.0菌種、YF-L904菌種、R-707菌種，科漢森菌種生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

膠體磨，常州華奧儀器制造有限公司；HJJ-6水浴恒溫電動(dòng)攪拌器，常州華奧儀器制造有限公司；SVJ-358智能商用型酸奶機(jī)，北京世紀(jì)陽光有限公司；高壓均質(zhì)機(jī)SRH，上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州華奧儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝設(shè)計(jì)

（1）工藝流程。

去皮核桃仁→清洗及浸泡→打漿→過濾去渣→磨漿→核桃乳→配料→預(yù)熱→均質(zhì)→殺菌→接種發(fā)酵→植物基核桃酸奶

（2）操作要點(diǎn)。

①清洗及浸泡：將核桃仁置于25℃蒸餾水中，按料液比1∶3（w/v）在浸泡16 h，備用。

②預(yù)熱：在50～60℃下加熱10 min，過60目篩進(jìn)行均質(zhì)。

③均質(zhì)：采用二次均質(zhì)對核桃乳進(jìn)行均質(zhì)，先在20 MPa均質(zhì)壓力下均質(zhì)5 min；再在40 MPa的更高壓強(qiáng)下均質(zhì)10 min。

④殺菌：在75～85℃條件下殺菌15 min，既要保證充分殺菌，又不能對核桃蛋白造成過度變性，以免影響植物基酸奶的質(zhì)地及風(fēng)味。

⑤接種發(fā)酵：接種1.2%菌種發(fā)酵液，在31.5℃下發(fā)酵16 h，進(jìn)一步促進(jìn)植物基酸奶的形成及產(chǎn)酸產(chǎn)香。

⑥后熟：植物基核桃酸奶發(fā)酵結(jié)束后，在4℃條件下冷藏后熟24 h，進(jìn)一步后熟產(chǎn)酸產(chǎn)香，完善酸奶的風(fēng)味和滋味。

1.3.2 菌種活化

使用直投式乳酸菌混合菌種。接種在MRS肉湯中，37℃培養(yǎng)24 h，激活乳酸菌。制備核桃乳培養(yǎng)基（打漿后的核桃乳，按5∶1與牛奶復(fù)配），連續(xù)3次進(jìn)行活化；將1 mL解凍的儲(chǔ)備培養(yǎng)物接種100 mL無菌核桃乳培養(yǎng)基中，并在37℃下培養(yǎng)，直到p H達(dá)到4.5時(shí)制備發(fā)酵劑[11-12]。

1.3.3 菌種篩選

以感官評分及p H為指標(biāo)，對直投式乳酸菌種進(jìn)行篩選。

1.3.4 單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以植物基核桃酸奶p H 4.5時(shí)的發(fā)酵時(shí)間TpH4.5（h）、感官評分、持水性為分析指標(biāo)，考察低聚果糖添加量（%）、發(fā)酵溫度（℃）、科漢森菌種YF-L904發(fā)酵劑接種量（%）對植物基核桃酸奶的影響，確定響應(yīng)面優(yōu)化最佳工藝因素水平。利用響應(yīng)面二次中心組合試驗(yàn)，以低聚果糖添加量X1（%）、發(fā)酵溫度X2（h）、發(fā)酵劑接種量X3（%）為自變量，以TpH4.5、感官評分、持水性為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面二次中心組合試驗(yàn)優(yōu)化植物基核桃酸奶最佳工藝配方。響應(yīng)面二次中心組合優(yōu)化試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面二次中心組合優(yōu)化試驗(yàn)的因素及水平

1.3.5 產(chǎn)品質(zhì)量

1.3.5.1 感官評定

選擇10名專業(yè)人士組成評定小組（5名男性，5名女性）對植物基核桃酸奶的感官特性進(jìn)行評估。在色澤和外觀（5分）、滋味（5分）、氣味（5分）、組織狀態(tài)（5分）4個(gè)方面進(jìn)行感官評定。其感官評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 植物基核桃酸奶的感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.5.2 產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)測定

（1）持水性測定。

參考熊政委[13]等方法并稍作修改。取10 m L核桃酸奶放入離心管。使用電子天平稱量離心管質(zhì)量記W1，加入植物基核桃酸奶后的總質(zhì)量記為W2，4 000 r/min，離心10 min，靜置10 min，去除上清液后，剩余質(zhì)量記為W3。持水性計(jì)算公式：

式中：W1為離心管質(zhì)量；W2為植物基核桃酸奶總質(zhì)量；W3為去除上清液后，剩余質(zhì)量。

（2）發(fā)酵過程中植物基酸奶p H測定。

根據(jù)p H計(jì)使用說明，對p H計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)，用玻璃電極對發(fā)酵過程中的植物基核桃酸奶每10 min測量一次p H值。

（3）黏度的測定。

使用校正后的旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)進(jìn)行測定3次，最終結(jié)果取平均值[14]。

（4）硬度的測定。

使用校正后的硬度計(jì)直接測定3次，最終結(jié)果取平均值。

（5）其他指標(biāo)。

蛋白質(zhì)含量：參照《GB 5009.5-2016凱氏定氮法》的方法測定；脂肪含量：參考《GB 5009.6-2016索氏抽提法》的方法測定；水分含量：參照《GB 5009.3-2016直接干燥法》的方法；碳水化合物含量：參照《GB 28050-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品營養(yǎng)標(biāo)簽通則》的方法測定；粗纖維含量：參照《GB/T 5009.10-2003植物類食品中粗纖維的測定》的方法測定；乳酸菌數(shù)測定：參照《GB 4789.35-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[15]；大腸桿菌檢測：參考《GB4789.3-2016食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》[16]。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析采用Excel 2013對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用設(shè)計(jì)專家Design-Expert8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析、利用SPSS24對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

植物基核桃酸奶所采用的乳酸菌種發(fā)酵劑能代謝植物蛋白制品中難以被人體快速吸收的寡糖類生成乳酸，從而提高植物蛋白的生物利用率，減少胃腸漲氣、同時(shí)促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，有助于消化和腸道健康；同時(shí)乳酸菌能賦予植物飲料“生物活性”的價(jià)值：合成維生素B族，水解蛋白質(zhì)和碳水化合物[17]，有宜于人體快速吸收營養(yǎng)；使植物基核桃酸奶在不含動(dòng)物成分，同時(shí)保留了酸奶和益生菌乳飲料所有的優(yōu)勢。

根據(jù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同菌種對植物基核桃酸奶的感官品質(zhì)和p H值有影響。篩選不同菌種對植物基核桃酸奶的感官品質(zhì)和pH值如圖1所示，發(fā)現(xiàn)p H值最高的菌株是1821DSL，同時(shí)感官評分最低，植物基核桃酸奶質(zhì)地不均勻，色澤較灰暗，口感及風(fēng)味較差。其次是鼠李糖乳桿菌。然而感官評分最高的菌株是YF-L904，p H值大概在5.8左右，植物基核桃酸奶組織細(xì)膩，色澤均勻，口感及風(fēng)味較好。發(fā)酵劑R-707和土耳其菌種發(fā)酵所得酸奶pH最低，但其對應(yīng)的酸奶口感和風(fēng)味不及YF-L904發(fā)酵所得。最終根據(jù)酸奶發(fā)酵的組織狀態(tài)、口感、風(fēng)味、感官評分和p H綜合分析篩選后，最終選定感官評分最高、口感及風(fēng)味較好、p H值適宜的直投式Y(jié)F-L904為植物基核桃酸奶最佳發(fā)酵菌株。

圖1 植物基核桃酸奶發(fā)酵菌株篩選結(jié)果

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)植物基核桃酸奶加工工藝流程及操作要點(diǎn)，篩選低聚果糖添加量（2.9%、4.9%、6.9%、8.9%、10.9%）、菌種接種量（0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%）、發(fā)酵溫度（25、30、35、40、45、50℃）對植物基核桃酸奶p H 4.5時(shí)的發(fā)酵時(shí)間、感官評分、持水性的影響，結(jié)果如圖2所示。

低聚果糖是一種可溶性膳食纖維，人體攝入后，由于不被消化吸收，因而能到達(dá)大腸被腸道內(nèi)有益菌群選擇性利用，促進(jìn)雙歧桿菌等有益菌的增殖，有效調(diào)節(jié)腸道菌群[18]。同時(shí)，低聚果糖在酸性條件下的穩(wěn)定性優(yōu)于蔗糖，且較蔗糖甜味清爽，味道純凈，不帶任何后味，甜度不會(huì)發(fā)生變化，對植物基核桃酸奶的口味沒有影響。低聚果糖的熱量很小，不會(huì)導(dǎo)致肥胖，并且具有良好的生理功能[19]，還能解決人們?nèi)樘悄褪苄詥栴}，增加水溶性可吸收鈣的含量，使乳制品更易消化吸收。由圖2（a）可知，在菌種接種量3.5%，發(fā)酵溫度40℃條件下，考察低聚果糖添加量對植物基核桃酸奶的影響。添加低聚果糖后，植物基核桃酸奶除了感官評分之外，TpH4.5和持水性隨著低聚果糖添加量增加而增加，當(dāng)?shù)途酃翘砑恿吭?.9%時(shí)，感官評分最高，TpH4.5和持水性出現(xiàn)緩慢增加，最終趨于平緩的趨勢。隨著乳低聚果糖添加量的增加，植物基酸奶口感逐漸變差，主要原因是由于低聚果糖添加量過多可能會(huì)增加甜味，導(dǎo)致植物基核桃酸奶過甜。因此，確定低聚果糖添加量為6.9%為宜。

由圖2（b）可知，在低聚果糖添加量6.9%，發(fā)酵溫度40℃條件下，植物基酸奶的感官評分、TpH4.5和持水性隨著菌種接種量的增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。當(dāng)菌種接種量在3.5%時(shí)，植物基酸奶的感官評分、TpH4.5和持水性最高，隨后感官評分、TpH4.5和持水性降低，這說明菌種接種量的添加對植物基酸奶形成有較大影響，菌種接種量添加過少，酸奶發(fā)酵不成功，產(chǎn)生明顯沉淀，呈現(xiàn)比較稀的狀態(tài)即組織狀態(tài)差、伴有有乳清析出等，菌種接種量添加過多造成酸奶酸度過高，最終感官評分、TpH4.5和持水性低，本實(shí)驗(yàn)與楊露西[20]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。因此，低聚果糖添加量為6.9%最佳。

發(fā)酵溫度可以影響植物基核桃酸奶的持水性，同時(shí)可能對植物基核桃酸奶的TpH4.5和感官評分具有一定影響。由圖2（c）可知，在低聚果糖添加量6.9%、菌種接種量3.5%條件下，隨著發(fā)酵溫度的升高，植物基酸奶的感官評分、TpH4.5和持水性均呈先上升后下降趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到40℃時(shí)，其感官評分、TpH4.5和持水性均達(dá)到最大值。而發(fā)酵溫度過低時(shí)出現(xiàn)凝乳不夠完全、產(chǎn)酸產(chǎn)香不足的問題，當(dāng)發(fā)酵溫度為過高時(shí)，出現(xiàn)乳清析出、組織狀態(tài)變差的現(xiàn)象。因此，最佳植物基核桃酸奶發(fā)酵溫度為40℃。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以低聚果糖添加量X1（%）、發(fā)酵溫度X2（℃）、發(fā)酵劑接種量X3（%）為自變量，以TpH4.5、感官評分、持水性為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面進(jìn)行3因素5水平二次中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3，回歸分析見表4。

表3 響應(yīng)面二次中心組合試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.3.2 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert8.0.6軟件對表5進(jìn)行多元回歸擬合，得到核桃酸奶發(fā)酵時(shí)間（Y1）、感官評分值（Y2）、持水性（Y3）與低聚果糖添加量（X1）、菌種接種量（X2）、發(fā)酵溫度（X3）的二次方程模型為：

Y1=18.46-1.41X1-0.34X2-0.73X3+0.38X1X2+0.30X1X3-0.62X2X3-0.15X12-0.42 X22-0.33X32

Y2=10.89-0.27X1-1.81X2-1.20X3+1.75X1X2-1.50 X1X3+1.50X2X3+1.64X12+0.76X22+1.64X32

Y3=0.83-0.030X1-0.14X2-0.079X3+0.11X1X2-0.096 X1X3+0.12X2X3+0.091X12+0.024 X22+0.093X32

回歸模型的方差分析結(jié)果見表4。

表4 回歸模型方差分析表

采用方差分析對TpH4.5、感官評分、持水度進(jìn)行回歸模型、個(gè)體模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。由表4、表5可知：植物基核桃酸奶TpH4.5、感官評分、持水性回歸模型顯著性檢驗(yàn)P值均＜0.01，說明3個(gè)響應(yīng)指標(biāo)二次多元回歸模型極顯著；植物基核桃酸奶TpH4.5、感官評分、持水性失擬性檢驗(yàn)P值均＞0.05，可以認(rèn)為3個(gè)響應(yīng)指標(biāo)二次回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合性模型失擬不顯著。說明模型可以接受，即表明所選植物基核桃酸奶TpH4.5、感官評分、持水性二次回歸模型可用于預(yù)測設(shè)定的參數(shù)，即可用于評估植物基核桃酸奶的TpH4.5、感官評分、持水性變化。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，能夠準(zhǔn)確的分析和預(yù)測植物基核桃酸奶植物基核桃酸奶TpH4.5、感官評分、持水性，說明實(shí)驗(yàn)操作可信度高，具有一定實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表5 響應(yīng)與過程變量之間關(guān)系的二階多項(xiàng)式方程的回歸系數(shù)

2.3.3 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

通過響應(yīng)面法優(yōu)化核桃酸奶制作的最佳工藝條件如表6所示。

表6 最佳工藝參數(shù)預(yù)測和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，植物基核桃酸奶的生產(chǎn)是由多種因素共同影響。響應(yīng)面優(yōu)化最佳條件為：低聚果糖添加量為9.3%，接種量為1.2%，發(fā)酵溫度為31.5℃，在此條件下，植物基核桃酸奶p H降至4.5時(shí)的發(fā)酵時(shí)間為16 h，感官評分18.93分，持水性1.33%。響應(yīng)面優(yōu)化出的此配方工藝可信度為91.7%。通過RSM優(yōu)化核桃酸奶的最佳工藝配方，并進(jìn)行了試驗(yàn)驗(yàn)證，3次試驗(yàn)的平均值與預(yù)測值吻合較好，均在可接受的范圍內(nèi)。

2.4 植物基核桃酸奶的產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)測定

植物基核桃酸奶的產(chǎn)品質(zhì)量指標(biāo)如表7所示。

表7 植物基核桃酸奶的理化特性

由表7可知，制備的植物基核桃酸奶硬度為423.1 g，黏度為9 304 mPa·s，持水性為1.33%，說明該產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性達(dá)到最優(yōu)，蛋白質(zhì)含量達(dá)到5.28%，與市面上的酸奶相比，高于大部分酸奶蛋白質(zhì)含量，是一種高蛋白的酸奶，脂肪含量達(dá)到22.67%，由于核桃中具有較高的不飽脂肪酸，特別是油酸、亞油酸及亞麻酸，容易被人體消化吸收，不易在體內(nèi)形成脂肪堆積導(dǎo)致身體發(fā)胖[21]，水分含量為52.04%，植物基核桃酸奶呈現(xiàn)出組織細(xì)膩、質(zhì)地均勻的狀態(tài)，粗纖維含量為0.47%，乳酸菌數(shù)為1.65×109CFU/g和大腸菌群未檢出，符合國家標(biāo)準(zhǔn)。與動(dòng)物酸奶相比，植物基核桃酸奶不僅蛋白質(zhì)含量可以達(dá)到動(dòng)物酸奶標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)具有不含膽固醇、低脂肪、易消化等優(yōu)點(diǎn)，且植物基核桃酸奶不含乳糖，對乳糖不耐癥人群十分友好。

3 結(jié)論

純植物基核桃酸奶加工的最佳發(fā)酵劑菌種為直投式Y(jié)F-L904菌種，其低聚果糖添加量為9.3%，接種量為1.2%，發(fā)酵溫度為31.5℃。此條件下，發(fā)酵16 h后植物基核桃酸奶pH降至4.5時(shí)的植物基核桃酸奶色澤呈乳白色，香氣濃郁，滋味厚重，凝固性好，其硬度為423.1 g、黏度9 304 mPa·s、持水性1.33%，整體感官品質(zhì)較佳；蛋白質(zhì)含量5.28%，脂肪含量22.67%，水分含量52.04%，粗纖維0.47%，乳酸菌數(shù)為1.65×109CFU/g、大腸桿菌未檢出，開發(fā)的植物基核桃酸奶是一款高蛋白、低脂肪的純植物基酸奶，具有一定的新穎性，營養(yǎng)價(jià)值高，具有一定的市場前景，同時(shí)核桃酸奶產(chǎn)品的開發(fā)對核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展也具有一定的推動(dòng)意義。