宋健

(沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所理化檢驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110136)

0 引言

明膠為水溶性蛋白質(zhì)高分子多肽高聚物，是由不同動(dòng)物中的膠原經(jīng)部分水解而獲取[1]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，廣泛用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。明膠作為一種親水性保護(hù)膠體，乳化作用強(qiáng)[2]，能夠有效抑制乳制品等高蛋白食品因胃酸而產(chǎn)生的凝聚反應(yīng)，從而快速促進(jìn)乳制品等食品的消化[3]。然而工業(yè)明膠與食品級(jí)明膠不同，其危害人體健康。工業(yè)明膠在制造過(guò)程中產(chǎn)生大量的六價(jià)鉻和砷等[4]，并且使用五氯苯酚作為防腐劑，因此國(guó)家禁止將工業(yè)明膠添加到食品中[5]。目前單純對(duì)于明膠的測(cè)定無(wú)法區(qū)別工業(yè)明膠和食品級(jí)明膠。針對(duì)于工業(yè)明膠的檢測(cè)研究非常少。

目前，我國(guó)的食用明膠行業(yè)發(fā)展迅速，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊，明膠在乳品中的需求將不斷增長(zhǎng)。明膠在不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求刺激下，乳制品生產(chǎn)商不得不在配方中使用多種成分明膠產(chǎn)品[6-8]，使其滿足需求。市場(chǎng)的迅速發(fā)展以及利益驅(qū)使下，明膠摻假現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，因此需要加強(qiáng)乳制品明膠檢測(cè)的監(jiān)督與管理。本研究在分析明膠和乳制品特性的基礎(chǔ)上，研究不同明膠檢測(cè)方法的應(yīng)用特性，為乳制品中明膠的檢驗(yàn)提供有利依據(jù)。

1 明膠在乳制品行業(yè)的應(yīng)用

明膠是一種大分子親水性蛋白質(zhì)混合物，使用過(guò)程中能夠達(dá)到起泡和穩(wěn)泡的效果[9]。明膠因特殊的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)在乳制品生產(chǎn)過(guò)程中起到多種功能。明膠通過(guò)氫鍵作用[10]阻止乳清析出，避免酪蛋白的收縮反應(yīng)，阻止固相從液相中產(chǎn)生分離；明膠可以為酪蛋白提供穩(wěn)定的環(huán)境，防止酪蛋白在酸性環(huán)境下中會(huì)失去乳化能力[11]；明膠與水結(jié)合形成明膠薄層覆蓋脂肪球[12]，包裹空氣氣泡，從而保持穩(wěn)定的乳化狀態(tài)。

明膠可以使低脂酸奶達(dá)到類似高奶油含量酸奶的組織狀態(tài)，在軟質(zhì)干酪生產(chǎn)過(guò)程中通過(guò)與水結(jié)合起到穩(wěn)定效果，有效阻止乳清的析出[13-15]。由于明膠融點(diǎn)非常接近人體溫度，使得明膠產(chǎn)品具有滑潤(rùn)細(xì)膩的口感和風(fēng)味。明膠能夠抵抗游離水受熱變化所引起的食品變質(zhì)，從而減緩冰晶的成長(zhǎng)[16]，降低溫度對(duì)冰激凌存儲(chǔ)時(shí)間的影響，進(jìn)而減慢冰激凌的融化速度。

2 分析方法

明膠獨(dú)特的高分子結(jié)構(gòu)特性賦予其多種功能，這些功能使其廣泛應(yīng)用于生活各方各面。明膠的大量應(yīng)用的同時(shí)，加強(qiáng)明膠檢測(cè)與監(jiān)管成為一種必然需求[17-19]。目前，各界學(xué)者比較認(rèn)可的明膠檢測(cè)方法主要包括光學(xué)與光譜法[20]、沉淀分離法、液相-色譜法、免疫吸附法。本文對(duì)上述方法的特點(diǎn)與局限性進(jìn)行詳細(xì)分析，如表1所示。

表1 多種明膠檢測(cè)方法的比較

2.1 光學(xué)分析與光譜技術(shù)法

光學(xué)分析法是基于明膠中特定物質(zhì)對(duì)光的選擇吸收而建立的分析方法，其中包括比色法、紫外分光光度法、紅外分光光度法等。

動(dòng)物明膠中的膠原蛋白經(jīng)過(guò)濃酸的水解作用，分離出其特有的羥脯氨酸，其經(jīng)過(guò)氯胺T的氧化作用，最終轉(zhuǎn)化成含有吡咯環(huán)的氧化物[21]。用高氯酸分解過(guò)量的氯胺T后，羥脯氨酸氧化物與對(duì)二甲氨基苯甲醛相互作用生成紅色的化合物，然后利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其吸光值[22]，最后與標(biāo)準(zhǔn)系列定量比較。此方法不需要衍生，簡(jiǎn)單有效，檢測(cè)成本低。

分光光度是一種檢測(cè)明膠中特定物質(zhì)含量的傳統(tǒng)方式，常規(guī)的分光光度法要輔助一定的分離手段以提高檢驗(yàn)準(zhǔn)確度，操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用較廣。原子吸收光譜法是將待測(cè)樣品氣化為基態(tài)原子，然后分析特征線譜和線譜被削弱程度的一種方法。在一定檢測(cè)范圍內(nèi)，吸光度與被測(cè)元素濃度成正比。此方法是測(cè)定明膠中鉻含量的主要方法[23]，可避免分光光度法測(cè)定的缺陷?？煞譃榛鹧嬖游辗ê褪珷t原子吸收法[24]。石墨爐原子吸收法通過(guò)微波消解法和超聲提取法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，采用原子吸收分光光度計(jì)石墨爐法測(cè)定總鉻和六價(jià)鉻含量[25]，有較好的檢出限，不受干擾，穩(wěn)定性能滿足檢測(cè)要求，準(zhǔn)確度好，能直接分析固體及較高的溶液試驗(yàn)等優(yōu)點(diǎn)，但其受干擾較嚴(yán)重，不適合做多元素分析。

太赫茲波譜[26]技術(shù)作為一種新型的檢測(cè)技術(shù)近年來(lái)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，由于其特征光譜對(duì)很多極性大分子具有較強(qiáng)的吸收特性，更容易檢測(cè)和鑒別有毒的物品和復(fù)雜異物。明膠樣品在經(jīng)過(guò)研磨等處理后，采用太赫茲投射式實(shí)驗(yàn)后，可以看出食品級(jí)明膠和工業(yè)明膠存在明顯差異[27]，食品級(jí)明膠的吸光度隨著頻率增加而上升，工業(yè)明膠吸光度則有著明顯的上升后下降的趨勢(shì)。

2.2 沉淀分離法

沉淀法是利用沉淀反應(yīng)，將被測(cè)明膠的某種特定元素轉(zhuǎn)變成為難容物質(zhì)，并將其從溶液中分離為沉淀物，測(cè)定其重量以完成對(duì)被測(cè)明膠含量的檢測(cè)。根據(jù)沉淀劑的不同，可分為試劑沉淀法、鹽沉淀法以及化學(xué)沉淀法。魏戰(zhàn)峰、楊水云等借助硝酸汞和苦味酸的分步沉淀法[28]沉淀乳制品的乳蛋白和明膠，從而完成對(duì)原料奶中有無(wú)明膠的定性檢測(cè)。為了防止乳制品中乳蛋白沉淀不徹底而導(dǎo)致明膠檢測(cè)的假陽(yáng)性，硝酸汞的含量必須嚴(yán)格滿足相應(yīng)的檢測(cè)要求?？辔端崤c明膠相互作用會(huì)形成非均相沉淀，形成絮狀漂浮物[29]。此種方法可采用試劑盒方式快速檢驗(yàn)。Hidaka和Liu等利用明膠能夠有效促進(jìn)烴基磷灰石形成從而強(qiáng)化磷酸鈣的形成的特性，從而通過(guò)明膠和磷酸鈣沉淀的相互反應(yīng)測(cè)定明膠來(lái)源[30]。

分步沉淀法檢測(cè)明膠的敏感度和穩(wěn)定性都較高，且能夠?qū)崿F(xiàn)快速檢測(cè)，但由于沉淀法容易受到被測(cè)乳制品中其他食品添加劑的干擾，因此會(huì)為明膠檢測(cè)帶來(lái)一定困難，需要優(yōu)化沉淀劑和試劑用量，加強(qiáng)檢測(cè)方法的抗干擾能力。

2.3 液相色譜-質(zhì)譜法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以液相色譜法因?qū)Ρ粶y(cè)物結(jié)構(gòu)破壞性小，分離范圍廣，可作為快速分離系統(tǒng)，質(zhì)譜法因靈敏度高，結(jié)構(gòu)分析準(zhǔn)確度高，可作為檢測(cè)系統(tǒng)。純化后的樣品在液相色譜法下分離和離子化，經(jīng)測(cè)量?jī)x器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)的互補(bǔ)，有效利用色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力和質(zhì)譜的高選擇性[31]，在食品檢測(cè)等領(lǐng)域有普遍的應(yīng)用。因此色譜-質(zhì)譜聯(lián)用成為分析微量有機(jī)混合物的有效方法。

明膠作為膠原蛋白的降解物主要由不同分子量的多肽[32]組成。這些多肽可被胰蛋白酶繼續(xù)降解，降解后的多肽經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分析后，比較多肽的氨基酸序列差異，分析特征肽的種類以鑒別明膠。高效液相色譜法對(duì)酶分解后的明膠多肽特征識(shí)別，根據(jù)色譜圖峰面積分析比較脯氨酸和羥脯氨酸含量高低，完成對(duì)明膠含量的檢測(cè)，檢測(cè)流程如圖1所示。劉琳等通過(guò)纖維連接蛋白（FN）能夠與明膠多肽反應(yīng)結(jié)合的性質(zhì)[33-34]，采用親和層析法分離出牛乳中的明膠多肽[35]，依據(jù)明膠多肽蛋白質(zhì)的分布特性，利用親和介質(zhì)分離法[36]，通過(guò)比較多肽質(zhì)譜[37]的峰強(qiáng)度高低判別被測(cè)物質(zhì)是否為明膠多肽。液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)作為分析多肽組成、結(jié)構(gòu)和功能重要方法之一，在結(jié)合蛋白質(zhì)酶切技術(shù)的基礎(chǔ)上，能夠較為有效鑒別明膠，但檢測(cè)樣品前處理和分析手段較復(fù)雜，存在一定的改進(jìn)空間。

圖1 液相色譜-質(zhì)譜法明膠的檢測(cè)流程

M.T.Y.Yilmaz改進(jìn)了HPLC-MS/MS法應(yīng)用了超高效液相色譜串聯(lián)電噴霧電離-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(nanoUPLC-ESI-q-TOF-MSE)方法通過(guò)檢測(cè)明膠中的標(biāo)記肽以鑒別乳制品中的明膠來(lái)源[38]。在測(cè)試了豬明膠和牛明膠對(duì)應(yīng)的獨(dú)特氨基酸序列后檢測(cè)乳制品中提取出的明膠[39-40]。此方法在識(shí)別乳制品中使用的明膠來(lái)源有著巨大潛力。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）作為一種特殊的試劑分析檢測(cè)方法，是基于免疫酶技術(shù)的一種新型免疫測(cè)定技術(shù)手段。此方法主要采用抗原與抗體的特異性反應(yīng)將被測(cè)物與酶結(jié)合[41]，通過(guò)酶與底物產(chǎn)生特殊的顏色反應(yīng)，用于定量檢測(cè)。ELISA常用檢測(cè)方法主要包括競(jìng)爭(zhēng)法、雙抗體夾心法、抑制性測(cè)定法、間接法[42]。其中間接法是目前最常用的方法，如圖2所示，加入底物顯色，底物降解的量即為被測(cè)樣本抗體的量。

圖2 間接酶聯(lián)免疫吸附法示意圖

Venien等學(xué)者為了在低敏感性條件下獲得更多特定抗體，增加了抗體對(duì)膠原蛋白特定序列的抵抗，通過(guò)使用多克隆抗體，顯示氨基酸的序列變化[43-44]。于是他們從牛明膠鏈的末端肽序列選擇了一種作為肽1，從牛明膠鏈的中間部位選擇一種公認(rèn)的物種特異性序列作為肽2?？闺?抗體的反應(yīng)活性在與抗肽2抗體相比較時(shí)表現(xiàn)為較低的活性狀態(tài)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，抗肽2抗體與牛明膠的反應(yīng)比豬明膠的反應(yīng)更劇烈。為了進(jìn)一步分析研究，當(dāng)通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)法ELISA分析研究同樣的明膠混合物時(shí)，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，鑒別豬明膠中的牛明膠獲得了高的靈敏度。而鑒別高凝凍強(qiáng)度豬明膠中的高凝凍強(qiáng)度牛明膠更為敏感[45-46]。因此，這種ELISA檢測(cè)技術(shù)可以用來(lái)區(qū)分牛和豬的明膠。盡管此種檢測(cè)方法在檢驗(yàn)靈敏度等方面存在其特有的優(yōu)越性，在檢測(cè)熟肉過(guò)程中存在的假陽(yáng)性結(jié)限制了其在食品檢測(cè)中的應(yīng)用，未來(lái)要在其抗干擾性方面加強(qiáng)研究。

3 討論

明膠作為一種穩(wěn)定劑在乳制品制作和存儲(chǔ)過(guò)程中起到不可或缺的作用。食用明膠市場(chǎng)的缺口又造成乳制品生產(chǎn)過(guò)程中明膠添加的非法使用，乳制品中明膠的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)成為市場(chǎng)的必然要求。傳統(tǒng)的光譜技術(shù)與液相色譜技術(shù)一定程度上能夠檢測(cè)乳制品中的明膠源，在采用合理方法分離出明膠多肽后，通過(guò)檢測(cè)明膠多肽特有的羥脯氨酸實(shí)現(xiàn)明膠的快速檢測(cè)，這種方法具有快速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。兩步沉淀分離法能夠?qū)崿F(xiàn)乳制品明膠的快捷檢測(cè)，選擇合適的沉淀試劑能夠保證明膠的高靈敏性檢測(cè)，但容易受到外界因素干擾。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法等新型檢測(cè)方法以其高靈敏度、可靠性等特點(diǎn)成為明膠檢測(cè)方向，此方法利用抗原與抗體結(jié)合的特異性，可實(shí)現(xiàn)明膠的定性與定量檢測(cè)。未來(lái)的研究需要提高檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化，促進(jìn)檢測(cè)產(chǎn)品的集成化，將基因檢測(cè)技術(shù)、生物技術(shù)、材料技術(shù)等相互融合，以實(shí)現(xiàn)明膠檢測(cè)全面化發(fā)展。同時(shí)，新工藝和新技術(shù)的迅速發(fā)展也會(huì)促進(jìn)新明膠檢測(cè)技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)方式的多樣化。另外，在明膠的提取、純化以及抗外界因素干擾等方面也需要加強(qiáng)研究，為明膠檢測(cè)提供有利保障。