陳 渝 ， 李珊珊 ， 張嚴焱 ， 劉晨喆 ， 李 麗 ， 石麗君 ，2△

（北京體育大學(xué) 1運動生理教研室，2運動與體質(zhì)健康教育部重點實驗室，北京100084；3重慶大學(xué)體育學(xué)院，重慶400044）

我國患心血管疾病人數(shù)達2.9 億，病死率居首位，其中高血壓占2.45億，原發(fā)性高血壓在高血壓人群中的比例為90%～95%［1］。原發(fā)性高血壓的流行病學(xué)和臨床特征表明，同卵雙生子代在高血壓發(fā)生和發(fā)展階段存在不完全一致的現(xiàn)象［2］，表明表觀遺傳因素可能與高血壓有關(guān)。表觀遺傳受環(huán)境影響，能夠經(jīng)細胞分裂保留并持續(xù)存在［3］。DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要研究內(nèi)容之一，能夠抑制基因的表達［4］，DNA 去甲基化有利于基因的表達［5］。血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）是構(gòu)成血管壁的主體，是一種非終末分化細胞，易受異常環(huán)境的刺激，具有表型分化的能力［6］。病理條件時，VSMC可由高度分化的收縮表型向去分化的合成表型轉(zhuǎn)換［7］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PGC1α）可與多個因子結(jié)合參與調(diào)節(jié)VSMC的表型轉(zhuǎn)換，抑制VSMC由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)換［8-9］。孕期運動能夠增加子代血管平滑肌舒張功能［10］。孕期運動對高血壓子代血管是否也會產(chǎn)生這種影響，該影響是否與血管平滑肌表型改變有關(guān)，且這種改變是否受Ppargc1α基因（編碼PGC1α）去甲基化調(diào)控，目前尚未清楚。因此，本研究選用自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR；一種常用的基因型高血壓動物模型）及其正常血壓對照Wistar-Kyoto（WKY）大鼠為研究對象，探討孕期運動對高血壓大鼠子代血管結(jié)構(gòu)的影響及其表觀遺傳學(xué)機制，以期為孕期運動的推廣及運動處方的制定提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 動物分組及運動方案

選用SPF 級SHR 及其對照WKY 品系大鼠，各品系采用12周齡雄性和11周齡雌性進行配種，配種大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006。雌雄大鼠按1∶1 合籠配種，以見栓且陰道涂片見精子定為妊娠第1 天（gestation day 1，GD1），配種成功后取出雄鼠［11］。將孕鼠隨機分為孕期運動（p-WKY-EX 和p-SHR-EX）組和孕期安靜（p-WKY-SED 和p-SHR-SED）組，每組各25 只，飼養(yǎng)于北京體育大學(xué)動物房，飼養(yǎng)房濕度45%～55%，溫度22～24 ℃，12/12 h晝夜光照循環(huán)。每只孕鼠分籠飼養(yǎng)，選用國家標準嚙齒類動物繁殖專用飼料。本研究所有動物實驗均經(jīng)北京體育大學(xué)倫理委員會批準。

孕期運動方案參照Volpato 等［12］研究，雌鼠在一周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，配種前5 d 進行水環(huán)境適應(yīng)，水深10 cm，水溫34～35 ℃，每天適應(yīng)15 min。配種成功后，運動組進行游泳訓(xùn)練，前4 d為適應(yīng)性訓(xùn)練，水深40 cm，訓(xùn)練時間從20 min 開始，每天遞增10 min，從第5 天開始，每天運動60 min，每周運動6 天，直至GD19。為避免水環(huán)境對孕鼠產(chǎn)生影響，安靜組在運動組運動期間置于水深10 cm 的相同水環(huán)境中。訓(xùn)練結(jié)束后用水沖洗大鼠，并及時吹干大鼠毛發(fā)。每天游泳訓(xùn)練前監(jiān)測孕鼠體重和進食量，一部分孕鼠在GD21時，異氟烷麻醉并人道處死，剖腹取胎鼠，取雄性作為研究對象，監(jiān)測胎盤重量和胎鼠質(zhì)量；另一部分孕鼠分娩后，雄性子代母乳喂養(yǎng)21 d，然后按母鼠編號分籠并飼養(yǎng)到3月齡，每籠不超過3只。

2 主要試劑及儀器

兔抗骨橋蛋白（ostepontin，OPN）單克隆及α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和平滑肌肌球蛋白重鏈（smooth muscle moyosin heavy chain，SM-MHC）多克隆抗體（Abcam）；TET2 多克隆抗體、Maxima First Strand DNA Synthesis Kit、TaqMan Gene Expression Master Mix、Ppargc1α基因TaqMan探針（Rn00580241_m1，擴增長度94 bp）和Actb基因（編碼β-actin）TaqMan 探針（Rn00667869_m1，擴增長度91 bp）均購自Thermo Fisher；β-actin和β-tubulin單克隆抗體（CST）；EZ DNA Methylation-Gold Kit 和Quest 5-hmC? DNA ELISA Kit（ZYMO Research）；TIANgel Midi Purification Kit（Tiangen）。酶標儀和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Bio-Rad）；血壓監(jiān)測儀（Kent Scientific）。

3 主要方法

3.1 HE 染色 異氟烷麻醉后，斷頭處死大鼠。取子代3 月齡大鼠腸系膜動脈，將周圍脂肪組織小心剝離干凈，放入4%組織細胞固定液中4 ℃固定24 h，流水沖洗，常規(guī)石蠟包埋，5 μm 切片。HE 染色觀察血管結(jié)構(gòu)變化，顯微鏡觀察并拍照，Image-Pro Plus軟件統(tǒng)計血管內(nèi)徑與中膜厚度。

3.2 Western blot 將腸系膜動脈放入提前預(yù)冷含研磨珠的離心管中，按每10 mg 組織加入60 μL 配制裂解液，放入快速組織細胞破碎儀中，4 ℃勻漿。待組織裂解完全后，吸取勻漿液放入新的離心管中，4 ℃、13 400×g離心30 min，取上清液BCA 法檢測蛋白濃度。制備SDS-PAGE 樣品，上樣量為20 μg。電泳后，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5% BSA 封閉，放入Ⅰ抗（β-actin，1∶9 000；β-tubulin，1∶8 000；α-SMA，1∶600；OPN，1∶1 000；SM-MHC，1∶1 200；TET2，1∶500）中4 ℃孵育過夜。次日TBST 清洗，室溫孵育Ⅱ抗后，凝膠成像系統(tǒng)發(fā)光成像。β-actin 或β-tubulin作為內(nèi)參照，采用ImageJ 軟件對目的條帶和內(nèi)參照條帶灰度值進行分析。

3.3 RT-qPCR 從腸系膜動脈平滑肌提取RNA，采用Maxima First Strand DNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，TaqMan Gene Expression Master Mix 進行擴增反應(yīng)，擴增條件為 50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，之后擴增40 個循環(huán)（95 ℃ 15 s、60℃ 60 s）。目的基因表達采用2-ΔΔCt法進行相對定量［13］。

3.4 亞硫酸氫鹽測序法 提取腸系膜動脈基因組DNA，采用 EZ DNA Methylation-Gold Kit 對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理。隨后在Ppargc1α基因啟動子區(qū)CpG 島外圍（不含CpG 位點）進行PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖檢測，切膠，使用TIANgel Midi Purification Kit 對 DNA 回收純化；之后將 PCR 產(chǎn)物克隆至載體后，挑取10 個克隆進行測序。對Ppargc1α基因啟動子-833～-190 總共643 bp 進行甲基化測定，由于檢測序列過長，因此共設(shè)計了2 個反應(yīng)進行甲基化的測定。Ppargc1α基因引物：5′-TAGTTAATTTGTTTTAGGGTTGGT-3′，5′-ACCCAAACTCAACTTAAAACTAA-3′；5′-AAAGAAAAAAGGGGGATTYGTTG-3′，5′-CAACTTTAAATACCACCAACTCTA-3′。甲基化結(jié)果以甲基化百分比表示：甲基化CpG/（甲基化CpG+未甲基化CpG）×100%。

3.5 5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）測定 提取腸系膜動脈基因組DNA，按照Quest 5-hmC?DNA ELISA Kit操作進行，酶標儀檢測吸光度，根據(jù)擬合曲線，計算5hmC百分比。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準誤（mean±SEM）表示。多組間比較采用雙因素方差分析（two-way ANOVA，高血壓×運動）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 孕期運動顯著增加高血壓孕鼠胎盤效率

孕鼠進食量以取出雄鼠后次日（GD2）開始監(jiān)測，體重增長情況從配種成功后第1天（GD1）開始計算。如圖1A、B 所示，各組孕鼠孕期總進食量和總體重增長量無顯著差異（P＞0.05）。

如圖1C、D 所示，高血壓子代胎鼠（p-SHR-SED）體重與p-WKY-SED 組相比顯著下降（P＜0.01），而胎盤重量則顯著增加（P＜0.05），孕期運動顯著增加高血壓子代胎鼠體重（P＜0.01），單對胎盤重量無影響（P＞0.05）。胎盤效率=胎鼠重量/胎盤重量，反映了子宮空間效應(yīng)與營養(yǎng)供應(yīng)能力對胎兒的影響。如圖1E 所示，p-SHR-SED 組胎盤效率與 p-WKY-SED 組相比顯著降低（P＜0.01），p-SHR-EX 組胎盤效率與p-SHR-SED組相比顯著升高（P＜0.05）。

2 孕期運動降低高血壓子代大鼠血壓

p-SHR-SED 組 SBP、DBP 和 MAP 均顯著高于 p-WKY-SED 組（P＜0.01），而 p-SHR-EX 組 DBP 和 MAP與p-SHR-SED 組相比均顯著降低（P＜0.05）；p-SHRSED 組 HR 顯著高于 p-WKY-SED 組（P＜0.01），而孕期運動對正常血壓子代（p-WKY-EX）和高血壓子代（p-SHR-EX）HR均無顯著影響（P＞0.05），見圖2。

3 孕期運動抑制高血壓子代大鼠腸系膜動脈血管平滑肌由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)換

如圖 3A～D 所示，p-SHR-SED 組與 p-WKY-SED組相比血管內(nèi)徑顯著縮小（P＜0.01），血管中膜厚度及中膜厚度與內(nèi)徑比值均顯著增加（P＜0.01）；與p-SHR-SED 組相比，p-SHR-EX 組血管內(nèi)徑顯著增大（P＜0.05），血管中膜厚度及中膜厚度與內(nèi)徑比值均顯著減?。≒＜0.01）。

Figure 1. Food intake（A）and weight gain（B）of pregnant rats，and placental efficiency of male fetuses（C，D and E）. Food intake of pregnant rats was calculated from GD2 for 6 d in the first week，and 7 d in the following two weeks. Mean±SEM. n=15 in each group from pregnant rats（A and B）；n=46 in p-WKY-SED，n=39 in p-WKY-EX，n=40 in p-SHR-SED，and n=38 in p-SHR-EX from 8 pregnant rats（C，D and E）.*P＜0.05，**P＜0.01 vs p-WKY-SED group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs p-SHRSED group.圖1 孕鼠進食量和體重增長量及雄性胎鼠胎盤效率

Figure 2. Blood pressure and heart rate（HR）of the offspring. SBP：systolic blood pressure；DBP：diastolic blood pressure；MAP：mean arterial pressure. Mean±SEM. n=11.*P＜0.05，**P＜0.01 vs p-WKY-SED；#P＜0.05 vs p-SHR-SED.圖2 子代大鼠血壓和心率

為明確血管形態(tài)的變化是否與表型標志蛋白有關(guān)，采用Western blot 檢測各組子代腸系膜動脈血管平滑肌表型標志蛋白的表達。結(jié)果顯示，p-SHRSED 組收縮表型標志蛋白α-SMA 和SM-MHC 的表達與p-WKY-SED 組相比均顯著降低（P＜0.05），合成表型標志蛋白 OPN 則顯著升高（P＜0.05）；與p-SHRSED 組相比，p-SHR-EX 組 α-SMA 和 SM-MHC 蛋白表達均顯著增加，OPN蛋白表達顯著降低（P＜0.05），見圖3E。

Figure 3. Morphological changes and phenotypic marker proteins of mesenteric arteries from the offspring. A：representative images showing HE staining of the mesenteric artery in the offspring of 4 groups（scale bar=50 μm）；B：lumen diameter；C：medial layer thickness；D：the ratio of medial layer thickness to lumen diameter；E：the protein expression levels of α-SMA，SM-MHC and OPN in mesenteric arteries. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs p-WKY-SED group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs p-SHR-SED group.圖3 子代大鼠腸系膜動脈形態(tài)和表型標志蛋白表達

4 孕期運動抑制高血壓子代腸系膜動脈Ppargc1α基因高甲基化

首先，我們對子代大鼠腸系膜動脈PGC1α 蛋白表達進行檢測，如圖4A 所示，與p-WKY-SED 組相比，p-SHR-SED 組 PGC1α 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與p-SHR-SED組相比，p-SHR-EX組PGC1α表達顯著增加（P＜0.05）。為進一步明確PGC1α 蛋白表達的變化是否受轉(zhuǎn)錄水平的影響，我們對子代大鼠腸系膜動脈PGC1α mRNA 進行檢測，如圖4B 所示，各組mRNA 水平與蛋白表達趨勢一致。然后，對Ppargc1α基因啟動子區(qū)甲基化進行檢測，結(jié)果如圖4C～F 所示，各組Ppargc1α基因整體甲基化水平無顯著差異（P＞0.05）；對影響Ppargc1α基因轉(zhuǎn)錄的-219 bp CpG 位點甲基化水平進行分析顯示，p-SHR-SED組與p-WKY-SED 組相比，該位點甲基化水平顯著增加（P＜0.05）；p-SHR-EX 組與p-SHR-SED 組相比，該位點甲基化水平顯著降低（P＜0.05）。

5 孕期運動增加高血壓子代腸系膜動脈TET2 蛋白表達與5hmC水平

對各組子代大鼠腸系膜動脈TET2 蛋白表達進行檢測，如圖 5A 所示，p-SHR-SED 組 TET2 蛋白表達顯著低于p-WKY-SED 組（P＜0.05）；與p-SHR-SED 組相比，p-SHR-EX 組 TET2 蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05）。接著，提取腸系膜動脈DNA，檢測與去甲基化密切相關(guān)的5hmC含量，觀察孕期運動是否改變子代去甲基化，如圖 5B 所示，p-SHR-SED 組 5hmC 百分比顯著低于p-WKY-SED 組（P＜0.01），p-SHR-EX 組5hmC百分比顯著高于p-SHR-SED組（P＜0.05）。

討 論

Barker 學(xué)說認為，發(fā)育早期的不良環(huán)境因素可能導(dǎo)致胎兒生理機能發(fā)生永久性改變，增加日后患病的風(fēng)險［14］。原發(fā)性高血壓受遺傳和環(huán)境因素共同調(diào)控。運動作為一種重要的非藥物干預(yù)手段，對高血壓防治有著積極作用。而高血壓孕期能否進行運動，以及孕期運動對子代產(chǎn)生何種影響，目前尚未可知。本研究通過建立高血壓大鼠孕期運動模型，探討了孕期運動是否改善子代大鼠成年后血管重構(gòu)與表型轉(zhuǎn)換，以及可能參與的表觀遺傳機制。研究表明孕期運動可通過增加3月齡子代大鼠TET2蛋白表達，增加Ppargc1α基因啟動子-219 bp CpG 位點去甲基化，調(diào)控PGC1α蛋白表達，抑制血管平滑肌由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)換（圖6）。

出生體重是宮內(nèi)環(huán)境和孕婦與新生兒健康的重要評價指標。流行病學(xué)研究表明出生時低體重和增加的胎盤重量增加了成年患高血壓的風(fēng)險［15］。本研究檢測到高血壓大鼠子代胎兒體重較正常血壓對照組顯著降低，胎盤重量則顯著增加，這與Johnston等［16］的研究結(jié)果一致。胎盤效率被認為是胎兒生長的替代物，雖然胎盤效率由基因決定，但環(huán)境的變化也會改變胎盤效率［17］。本研究顯示，孕期運動增加了高血壓大鼠子代胎盤效率，故推測孕期運動能夠改善子宮環(huán)境，對胎兒健康具有積極影響。運動的這種影響可能與胎盤血流量增加、氧氣和營養(yǎng)轉(zhuǎn)運效率增加有關(guān)。

SHR 是人類原發(fā)性高血壓常用的動物研究模型。對SHR 和WKY 大鼠之間單細胞胚胎的相互交換表明，SHR 宮內(nèi)環(huán)境顯著增加WKY 基因型子代120 d 時的血壓，WKY 宮內(nèi)環(huán)境顯著降低同齡SHR基因型子代的血壓，表明子宮環(huán)境決定了WKY/SHR基因型在后期發(fā)生高血壓的敏感性［18］。在本研究中，孕期運動降低了SHR 子代DBP 和MAP，提示孕期運動可以通過改善宮內(nèi)環(huán)境降低高血壓大鼠子代成年后血壓。高血壓期間，阻力動脈尤其容易發(fā)生血管重構(gòu)，血管平滑肌出現(xiàn)部分收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)換［19］。我們對各組子代大鼠腸系膜動脈血管形態(tài)和平滑肌表型標志蛋白表達的檢測結(jié)果也表明，高血壓大鼠子代血管管徑減小，管壁增厚，VSMC 發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，孕期運動能夠有效抑制高血壓子代VSMC表型轉(zhuǎn)換，避免血管形態(tài)重構(gòu)。

在心血管疾病中PGC1α 主要參與VSMC 增殖和衰老。PGC1α 的失活可導(dǎo)致VSMC 肥大和衰老，而激活 PGC1α 可緩解 VSMC 的這種變化［20］。高血壓時，血管平滑肌細胞PGC1α 蛋白表達下調(diào)［21］。多項研究證實表觀遺傳學(xué)變化可在生理和病理環(huán)境中控制PGC1α 的基因表達［22-24］。為探討孕期運動是否對高血壓子代Ppargc1α基因去甲基化產(chǎn)生影響，我們首先對PGC1α蛋白進行檢測，結(jié)果顯示，孕期運動顯著增加高血壓子代 PGC1α 蛋白表達，且 PGC1α 蛋白表達的差異受轉(zhuǎn)錄水平影響。接著，我們對Ppargc1α基因的甲基化水平進行檢測，明確PGC1α轉(zhuǎn)錄水平的變化是否受表觀遺傳調(diào)控。Ppargc1α基因甲基化在人和小鼠均有研究，且Ppargc1α基因在啟動子區(qū)-260 bp CpG 位點附近的堿基序列在人、小鼠和大鼠的基因上是相同的，在此位點發(fā)生的DNA甲基化會抑制PGC1α 表達［24-25］。我們根據(jù)文獻提供的堿基序列查詢大鼠Ppargc1α基因序列顯示，人類-260 bp CpG 位點在大鼠DNA 序列中位于啟動子區(qū)-219 bp 的位置。因此，我們主要對Ppargc1α基因-219 bp CpG 位點附近的序列進行甲基化檢測。結(jié)果表明孕期運動顯著抑制了高血壓子代大鼠Ppargc1α基因該位點的高甲基化。TET 家族是參與DNA 去甲基化的關(guān)鍵酶，催化5mC 形成5hmC，導(dǎo)致DNA 去甲基化，增加基因表達［26］。我們對腸系膜動脈去甲基化相關(guān)指標的檢測結(jié)果表明，高血壓子代大鼠TET2 蛋白和5hmC 水平均顯著下降，而孕期運動增加二者水平。這提示，高血壓時大鼠腸系膜動脈DNA 去甲基化水平下降，減少PGC1α 表達，而孕期運動增加子代腸系膜動脈去甲基化水平，增加PGC1α表達。

Figure 4. Methylation level of Ppargc1α gene in the mesenteric artery from the offspring. A：the protein expression level of PGC1α；B：the transcription level of PGC1α；C：CpG sites in promoter region of Ppargc1α gene；D：representative DNA methylation status of the CpG sites of Ppargc1α gene（the solid circles represent methylated cytosines，and hollow circles denote unmethylated ones；7 CpG sites of the Ppargc1α gene and 10 clones were subjected to sequencing）；E：the percentage of methylation levels of all measured CpG sites within Ppargc1α gene；F：the methylation level of -219 bp CpG site. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs p-WKY-SED；#P＜0.05 vs p-SHR-SED.圖4 子代大鼠腸系膜動脈Ppargc1α基因甲基化水平

Figure 5. The levels of TET2 protein and 5hmC in ther mesenteric artery of the offspring. A：relative protein expression level of TET2 in each group；B：the level of 5hmC in each group. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs p-WKY-SED；#P＜0.05 vs p-SHR-SED.圖5 子代大鼠腸系膜動脈TET2表達與5hmC水平

Figure 6. Epigenetic mechanism of gestational exercise in regulating vascular remodeling in hypertensive offspring.圖6 孕期運動調(diào)節(jié)高血壓子代血管重構(gòu)的表觀遺傳機制圖

綜上所述，孕期運動可通過增加TET2 介導(dǎo)的Ppargc1α基因啟動子區(qū)去甲基化，抑制高血壓大鼠子代成年后血管平滑肌由收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)換，緩解其血管重構(gòu)。