辜淑君， 陳德暉△， 張抗抗， 麥凱琳， 顧瑩瑩， 古梓壕

（廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 1兒科，2病理科，廣東廣州510120）

閉塞性細支氣管炎（bronchiolitis obliterans，BO）是一種由小氣道損傷后炎癥及纖維化病變引起的慢性氣流阻塞性疾?。?］。BO 的發(fā)生常與嚴重感染、急性肺損傷、異體移植術(shù)后、吸入有毒物質(zhì)和自身免疫性疾病等有關(guān)［2］。成人BO 多與器官移植后宿主免疫反應(yīng)有關(guān)，約50%肺移植術(shù)后患者可發(fā)生BO［3］，3年病死率高達65%。

“BO”是病理診斷，指氣道內(nèi)2 mm以下的小氣道細支氣管黏膜下或外周炎癥細胞浸潤和纖維化致管腔狹窄，目前BO 的致病機制尚未明了，良好的動物模型有助于闡明BO 的發(fā)病機制和探索新的治療方法。移植后BO 常見移植物抗宿主反應(yīng)引起細支氣管廣泛炎癥反應(yīng)甚至管腔閉塞的改變。因此，本文擬構(gòu)建幼齡大鼠異位氣管移植的動物模型，以評估移植后幼齡大鼠細支氣管在不同時點的病理改變。

材料和方法

1 實驗材料

SPF 級 Wistar 大鼠 63 只和 SD 大鼠 21 只，雄性，約3 周齡左右，體重在60～70 g 左右，均為南方醫(yī)科大學動物中心提供。本研究所有動物的處理及實驗操作均通過廣州醫(yī)科大學動物管理與使用倫理委員會審批。

2 方法

2.1 實驗分組 術(shù)前2 組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1 周適應(yīng)環(huán)境后隨機分成2 組并做好標記。實驗幼齡大鼠主要分為異型移植（SW，n=42）組和同型移植（WW，n=42）組。

SW 組：SD 大鼠為供體（n=21），Wistar 大鼠為受體（n=21），供體和受體隨機配對后進行異位氣管移植，將供體氣管移植到受體頸背部皮下，分別在移植后第7、14 和28 天不同時段收取移植氣管，每個時段收取7只受體大鼠的樣本。

WW 組：供體（n=21）和受體（n=21）均為Wistar大鼠，供受體隨機配對后進行異位氣管移植，將供體氣管移植到受體頸背部皮下，分別在移植后第7、14和28 天不同時段收取移植氣管，每個時段收取7 只受體大鼠的樣本。

2.2 供體氣管的獲取 兩組供體大鼠使用2%戊巴比妥納（40 mg/kg）［4］腹腔注射麻醉后仰臥位在手術(shù)臺上固定，頸胸部備皮。外科無菌操作下行頸胸部正中切口切開皮膚，鈍性分離頸部纖維及肌肉組織，充分暴露氣管，解剖游離氣管旁纖維組織、神經(jīng)、血管及食管，用外科縫合線分別在左、右主支氣管叉處及環(huán)狀軟骨處與氣管上段結(jié)合處結(jié)扎并離斷整根氣管，用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗數(shù)次后放入含無菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，并放入冰盒中備用。

2.3 供體氣管植入受體 予受體Wistar 大鼠2%戊巴比妥納（40 mg/kg）［4］腹腔注射麻醉成功后以俯臥位固定在手術(shù)臺上，頸背部備皮。無菌操作下于頸背部正中處剪一長約2 cm小口，充分游離皮下組織，使其形成一個小囊腔［5］，用沾有生理鹽水的濕棉球清潔囊腔中滲出的血液，將移植氣管植入，并以外科縫合線逐層縫合囊腔周圍組織使氣管固定于囊腔中。外科縫合線縫合切口皮膚，再次消毒皮膚切口。

2.4 術(shù)后管理 術(shù)后將受體大鼠單獨置于清潔級鼠房內(nèi)觀察，全部大鼠30 min 內(nèi)清醒，肌力逐漸恢復(fù)，刺激疼痛有反應(yīng)。

術(shù)后大鼠正常飼養(yǎng)，每日每只大鼠大腿肌肉注射青霉素20萬U，連續(xù)3 d，使用碘伏消毒切口連續(xù)1周。每日觀察并記錄受體大鼠的切口生長狀況、活動狀況、體重、飲食、精神變化、毛發(fā)、排泄情況及對外界刺激反應(yīng)等。

2.5 樣本采集 分別于移植后第7、14 和28 天對2組受體大鼠在無菌操作下進行以下實驗步驟采集標本：（1）收取受體大鼠移植氣管：2組受體大鼠麻醉成功后，無菌操作下切開受體大鼠頸背部皮膚，取出移植氣管，氣管放入10%中性甲醛中固定待病理檢查；（2）受體大鼠肺組織的獲取：充分將肺與周圍組織分離，充分暴露后，結(jié)扎左主支氣管，右肺行肺泡灌洗，收取肺泡灌洗液后結(jié)扎右主支氣管并切取左右肺葉，存于10%中性甲醛溶液中，并標記。

2.6 組織學分析 將甲醛固定好的供體氣管及受體肺組織進行石蠟常規(guī)包埋，制成4 μm 的切片，進行HE 及免疫組化染色。組織切片描述與分析：HE和免疫組化染色后在光學顯微鏡下觀察移植氣管及受體大鼠肺小氣道的上皮細胞完整程度，纖維化程度、管腔閉塞程度及炎癥細胞浸潤程度。

3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，使用統(tǒng)計軟件Prism 5（Graphpad）行統(tǒng)計學做圖及分析。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，兩組間比較使用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 動物的一般情況

所有大鼠至標本采集階段存活情況良好，無死亡。從供體氣管獲取至氣管異位移植完畢平均用時（18±5）min。異型移植（SW）組與同型移植（WW）組受體大鼠術(shù)后無死亡，切口無感染。取少量動物連續(xù)觀察SW 組與WW 組受體大鼠術(shù)前和術(shù)后7 d的體重增長均無差異（P＞0.05），全體動物體重變化的定量分析統(tǒng)計結(jié)果見表1。

2 受體大鼠樣本的病理學觀察

2.1 受體大鼠樣本的HE 染色結(jié)果 WW 組移植氣管的病理學觀察：移植后第7 天時見移植氣管上皮細胞完整，可見輕微炎癥細胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生不明顯（圖1A）；第14天見移植氣管炎部分癥細胞浸潤，伴有部分纖維結(jié)締組織增生（圖1B）；第28 天見移植氣管炎癥細胞浸潤增多，伴有部分纖維結(jié)締組織增生（圖1C）。SW 組移植氣管病理結(jié)果：移植后第7 天時見移植氣管部分上皮細胞丟失，黏膜下層可見少量中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，管腔內(nèi)部分纖維結(jié)締組織增生（圖1D）；第14天見移植氣管上皮細胞丟失，可見黏膜下層有大量炎癥細胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生使管腔大部分閉塞，氣管壁周圍纖維結(jié)締組織增多（圖1E）；第28 天見移植氣管上皮細胞嚴重丟失，黏膜下層可見慢性炎癥細胞浸潤，增生的纖維結(jié)締組織使管腔完全閉塞，管壁周圍纖維組織增生明顯（圖1F）。

表1 SW組與WW組受體大鼠移植術(shù)前及術(shù)后體重變化Table 1. Comparison of the body weight between the recipient rats of SW group and WW group（g. Mean±SD. n=21）

Figure 1. Histopathological changes of the transplanted trachea on the 7th（A and D），14th（B and E）and 28th（C and F）days after transplantation in SW group and WW group（HE staining，×400）.圖1 SW組和WW組移植后7、14 和28 d移植氣管組織的病理學變化

WW 組受體肺組織的病理學觀察：氣管移植后第7 天時肺組織病理學改變不明顯，氣管上皮細胞完整，氣管壁無增厚，炎癥細胞浸潤不明顯，肺泡無明顯破壞（圖2A）；第14天時肺組織細支氣管周圍炎癥細胞浸潤不明顯，上皮細胞少量脫落，氣管壁增厚不明顯，氣管周圍小血管壁增厚不明顯，肺泡無明顯破壞（圖2B）；第28 天肺組織細支氣管上皮細胞少量脫落，氣管周圍炎癥細胞部分浸潤，氣管壁輕度增厚，肺泡壁周圍有少量炎癥細胞浸潤（圖2C）。SW組受體肺組織病理結(jié)果：供體氣管移植后第7 天，受體肺組織組織病理學改變輕微，氣道上皮細胞較完整，管壁增厚不明顯，僅有少量炎癥細胞浸潤，氣管周圍小血管壁輕度改變，肺泡周圍少量炎癥細胞浸潤（圖2D）；第14天肺組織細支氣管上皮細胞部分脫落，黏膜褶皺增多，氣管壁輕度增厚，肺泡周圍少量炎癥細胞浸潤伴肺泡破壞增多，氣管周圍小血管壁增厚（圖2E）；第28 天肺組織細支氣管炎癥細胞浸潤增多，纖維化明顯，伴有小血管管壁增厚，肺泡壁周圍可見少量炎癥細胞浸潤（圖2F）。

Figure 2. Pathological changes of lung tissue of recipient rats on the 7th（A and D），14th（B and E），and 28th（C and F）days after transplantation in SW group and WW group（HE staining，×200）.圖2 SW組和WW組移植后7、14和28 d受體大鼠肺組織的病理學變化

2.2 免疫組化染色觀察 （1）α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）：WW 組移植后7、14和28 d 的免疫組化染色顯示氣道管壁連續(xù)性較完整，肌纖維破壞不明顯；SW 組在移植后7、14 和28 d免疫組化染色顯示氣道平滑肌連續(xù)性較差，肌纖維破壞明顯，平滑肌層斷裂明顯（圖3A）；（2）波型蛋白（vimentin）：WW 組在移植后 7、14 和 28 d 的 vimentin免疫組化染色陽性較弱，氣道管壁及周圍纖維化不明顯；SW 組在移植后 7、14 和 28 d 的 vimentin 免疫組化染色陽性較WW 組明顯，且可看到SW 組小氣道管壁周圍纖維化較明顯，還伴有炎癥細胞增多（圖3B）；（3）E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-Cad）：WW組氣道管壁在移植后7、14 和28 d 較完整，上皮細胞少量脫落；SW 組上皮細胞脫落程度在移植后7、14 和28 d 較WW組嚴重（圖3C）。

討 論

BO 是一種以細支氣管炎性彌漫損傷為主所致的慢性氣流受限綜合征，病理主要表現(xiàn)為細支氣管的部分或完全閉塞，臨床表現(xiàn)為持續(xù)咳嗽、喘息和呼吸困難。文獻報道顯示，BO 發(fā)生發(fā)展的常見誘發(fā)因素多為嚴重感染、急性肺損傷或異體移植術(shù)后、吸入有毒物質(zhì)和自身免疫性疾病等［2］，引起B(yǎng)O 的病因較多，其中感染后BO 在兒童BO 最為常見。閉塞性細支氣管炎患兒喘息、低氧血癥和啰音可持續(xù)數(shù)月至數(shù)年，最后發(fā)展為復(fù)發(fā)性肺炎、復(fù)發(fā)性或慢性肺不張、肺心病、胸部畸形和杵狀指等［6］。當感染后BO患兒存在嚴重的氣流阻塞、肺功能持續(xù)降低、嚴重依賴氧療的終末階段BO 患兒可考慮進行肺移植［7］。成人多為移植后BO，與移植后移植物抗宿主反應(yīng)相關(guān)。有文獻顯示肺移植后的閉塞性細支氣管炎綜合征（bronchiolitis obliterans syndrome，BOS）進行肺再移植可提高患者存活率［8］。

隨著器官移植技術(shù)的發(fā)展，BO 作為異基因造血干細胞移植（hematopoletic stem cell transplantation，HSCT）和肺移植等器官移植后并發(fā)癥的發(fā)生率越來越高，這促使人們?nèi)ド钊胙芯緽O 的發(fā)病機制及干預(yù)靶點。因此，構(gòu)建一個合格的BO 動物模型有助于模擬臨床致病過程，并對進一步探討其潛在病理生理機制和開發(fā)新的BO 防治措施是非常有意義的。目前BO 存在多種動物模型，包括嚙齒類動物和大型動物的原位肺移植、原位氣管移植和氣管皮下、體表、腹腔［9］和肺內(nèi)等不同部位的異位移植。本研究成功建立一種幼齡SD 大鼠和Wistar 大鼠的氣管異位移植致閉塞性細支氣管炎的動物模型。結(jié)果提示實驗組SW 組的病理表現(xiàn)有氣道部分上皮細胞丟失、纖維結(jié)締組織增生、氣管炎癥細胞浸潤增多及氣道官腔部分閉塞或完全閉塞等的改變，與Lewis 及B-N 大鼠異位氣管移植模型報道基本相似［5］，成功地模擬了臨床BO 炎癥細胞浸潤，結(jié)締組織增生直到管腔閉塞的發(fā)展過程與病理學形態(tài)表現(xiàn)。由HE 染色可以看到，SW 組在移植后 7、14 和 28 d 移植氣管上皮細胞丟失、炎癥細胞浸潤、纖維組織增生以及管腔閉塞程度都比WW 組嚴重。免疫組化染色也顯示，SW 組樣本氣道平滑肌斷裂程度、管周纖維化程度及氣道上皮細胞脫落程度比WW 組更嚴重?？紤]是SW 組氣管異位移植產(chǎn)生排斥反應(yīng)更為強烈，產(chǎn)生大量炎癥因子釋放致組織損傷和異常修復(fù)。E-cad 是一類存在與于所有上皮組織中的跨膜糖蛋白，是調(diào)節(jié)細胞間黏附反應(yīng)的的主要介質(zhì)，對調(diào)節(jié)細胞運動、黏附和維持細胞形態(tài)具有重要作用［10］，其表達減弱甚至消失時，細胞間的黏附能力降低，從而更易出現(xiàn)細胞脫落或轉(zhuǎn)移。

Figure 3. Immunohistochemical observation on the expression of α-SMA（A），vimentin（B），and E-Cad（C）in the lung tissues of recipients on the 7th，14th and 28th days after transplantation in SW and WW groups（×200）.圖3 SW組和WW組移植后7、14和28 d受體肺組織α-SMA、vimentin和E-cad表達變化的免疫組化觀察

本研究使用3～4 周幼齡SPF 級SD 大鼠和Wistar大鼠進行頸背部異位氣管移植構(gòu)建BO 動物模型模擬兒童期BO 病程病理發(fā)展變化，實驗簡單，相對肺或氣管原位移植大鼠模型操作更容易，可重復(fù)性強，術(shù)后管理容易，可較好地避免了手術(shù)感染風險及減少了模型大鼠死亡風險。異位氣管移植基本模擬了臨床BO 病理組織損害，可應(yīng)用于移植后BO 機制研究［11］。對比氣管異位移植腹腔大網(wǎng)膜所致移植后BO模型［9］，頸背部環(huán)境可以排除腹腔體液的干擾，且更接近于生理氣管頸部微環(huán)境。但不足之處是相對于原位氣管移植，氣管異位移植由于氣管周圍環(huán)境完全封閉，氣管腔沒有空氣流通的環(huán)境。此外，兒童BO 主要在小氣道發(fā)生病變，而異位氣管移植模型采用的是大氣道主氣管進行造模，在反映小氣道發(fā)生病變可能較原位肺移植后BO 模型的病理改變較輕。但與其他BO 移植模型相比，在病理改變與實驗可行性上頸背部異位氣管移植構(gòu)建BO 模型有很大優(yōu)勢，對今后兒童BO 致病機制的研究可提供重要的數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，本研究所構(gòu)建的幼齡大鼠異位氣管移植動物模型的氣管病理改變可以誘發(fā)造模大鼠細支氣管氣道上皮細胞的脫落、纖維結(jié)締組織增多及淋巴細胞的浸潤和氣道管腔閉塞等改變，與Genden等［12］所構(gòu)建的BO動物模型病理改變相似，為成功構(gòu)建的幼齡大鼠異位氣管移植BO 動物模型，可為后續(xù)研究移植后BO機制與干預(yù)提供了實驗平臺。