錢玉玲，王維維，榮國(guó)強(qiáng)，成 蔚，單玲玲

（宿州學(xué)院，安徽宿州 234000）

蔓越莓，又稱蔓越橘，是杜鵑花科越橘屬的常綠小灌木，主要生長(zhǎng)在北半球的涼爽地帶酸性泥炭土壤中，在中國(guó)大興安嶺地區(qū)也比較常見［1］.蔓越莓提取物含有豐富的膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽等，其中富含的原花青素，由于其特殊的抗氧化能力，可避免細(xì)胞被破壞并維持細(xì)胞的健康與活力［2］.原花青素是一種存在于自然中的天然多酚，其主要結(jié)構(gòu)是兒茶素、表兒茶素或者二者之間的聚合體［3］，具有抗氧化、延緩人體衰老的作用，還可以治療消化系統(tǒng)疾病和尿道感染［4］，對(duì)糖尿病的治療也有輔助作用［5］.

從蔓越莓中提取原花青素的方法較多，如有機(jī)溶劑萃取法、微波輔助提取法、超聲波提取法、酶提取法［6］等.其中超聲波輔助提取法與其他方法相比更快捷，提取效率更高，操作簡(jiǎn)單，安全并對(duì)環(huán)境友好［7?8］.本研究采用微波輔助提取法萃取蔓越莓中的原花青素，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選工藝條件來(lái)提高其提取率，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行分析［9］，以期為我國(guó)蔓越莓資源的開發(fā)利用奠定一定的理論基礎(chǔ).

1 試驗(yàn)材料與儀器

試驗(yàn)材料蔓越莓為市售，原花青素標(biāo)準(zhǔn)品、丙酮、乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、石油醚均為國(guó)藥集團(tuán)分析純.

試驗(yàn)儀器有HI84?SYW140 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，白山市玖久儀器儀表有限公司家；UV?2810 型紫外可見分光光度計(jì)，HITACHI 公司；DJ?10A 傾倒式粉碎機(jī)，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；KQ?2200B型超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司；SHZ?D 循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限公司；RE?501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市科瑞儀器有限公司.

2 試驗(yàn)方法

2.1 蔓越莓的預(yù)處理

將蔓越莓洗凈，烘干，粉碎，過40目篩，石油醚脫脂，干燥備用.

2.2 提取工藝流程

蔓越莓粉末→加入提取劑→超聲波提取→抽濾→濃縮→冷凍干燥.

2.3 蔓越莓原花青素的鑒定

將原花青素標(biāo)準(zhǔn)品在紫外可見分光光度計(jì)的200～600 nm 波段掃描，檢測(cè)提取物與標(biāo)準(zhǔn)品波峰是否一致，以鑒定提取物是否屬于原花青素.

2.4 蔓越莓原花青素含量測(cè)定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取20.00 mg 原花青素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液.分別吸取0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 mL上述原花青素標(biāo)準(zhǔn)品溶液于7支具塞試管中，各加入甲醇定容至2 mL后，加入8.0 mL反應(yīng)混合液（按體積比為正丁醇∶濃鹽酸∶10%硫酸鐵銨=83∶6∶1），蓋緊塞子，振蕩搖勻，于沸水浴中反應(yīng)40 min，取出快速冷卻至室溫，以試劑空白為對(duì)照，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.每組均測(cè)定3次后取平均值，記錄數(shù)據(jù)，以吸光度值為橫坐標(biāo)，原花青素的濃度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程.

2.4.2 蔓越莓原花青素得率的計(jì)算

準(zhǔn)確吸取1.0 mL 定容后的蔓越莓原花青素浸提液，測(cè)定其在520 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣品濃度，蔓越莓原花青素得率的計(jì)算公式為：

式中：C為蔓越莓原花青素的濃度（μg/mL）；V 為稀釋后的原花青素溶液總體積（mL）；M 為樣品的質(zhì)量（μg）.

2.5 單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

分別考察超聲波輔助提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇濃度4 種因素對(duì)蔓越莓原花青素提取率的影響.其中超聲波輔助提取時(shí)間分別為20、30、40、50 min；提取溫度分別為40、50、60、70℃；料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50；乙醇濃度分別為25%、50%、75%、100%.

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)每個(gè)因素選擇合適的水平，應(yīng)用正交表見表1，開展L9（34）正交試驗(yàn)，根據(jù)收率得出蔓越莓原花青素的最佳提取工藝.

表1 正交試驗(yàn)因素水平

2.6 蔓越莓原花青素抗氧化能力測(cè)試

取1.0 mL 最優(yōu)提取工藝下提取出的蔓越莓原花青素抽濾液，稀釋10倍，分別加入1%，2%，3%，4%濃度的氧化劑雙氧水和過硫酸鉀各1.0 mL，混合均勻，使其暴露于空氣中，室溫下放置30 min，測(cè)定含量.

取1.0 mL 最優(yōu)提取工藝下提取出的蔓越莓原花青素抽濾液，稀釋10 倍，分別加入0.5%，1.0%，1.5%，2.0%濃度的還原劑硫酸亞鐵和硼氫化鈉各1.0 ml，混合均勻，使其暴露于空氣中，室溫下放置30 min，測(cè)定含量.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 提取時(shí)間對(duì)蔓越橘中原花青素提取效果的影響

從圖1可以看出，當(dāng)超聲波提取的時(shí)間變長(zhǎng)時(shí)，從蔓越莓中所得原花青素的得率先增大后減小，當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，原花青素得率為最大值，即已經(jīng)達(dá)到最大提取效率，若繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，原花青素得率反而會(huì)降低.這可能是因?yàn)樵ㄇ嗨氐慕Y(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，提取時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使一部分的原花青素的結(jié)構(gòu)遭到破壞而分解［10］，故40 min為最優(yōu)提取時(shí)間.

圖1 提取時(shí)間對(duì)蔓越莓中原花青素提取率的影響

3.2 提取溫度對(duì)蔓越莓中原花青素提取效果的影響

從圖2 可得，當(dāng)超聲波提取溫度升高的時(shí)候，原花青素的得率先升高后降低.當(dāng)提取溫度為60℃時(shí)，原花青素得率為最大值，如果繼續(xù)增高超聲波提取溫度，會(huì)造成花青素結(jié)構(gòu)被破壞，原花青素得率反而會(huì)降低.這是可能因原花青素是易氧化物質(zhì)，結(jié)構(gòu)不是特別穩(wěn)定，溫度過高時(shí)，原花青素的結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，溫度越高，原花青素被破壞的越多，故60℃為最優(yōu)提取溫度.

圖2 提取溫度對(duì)蔓越莓中原花青素提取率的影響

3.3 料液比對(duì)蔓越莓中原花青素提取效果的影響

從圖3 可以看出，當(dāng)料液比增加時(shí)，所得原花青素的得率先升高然后降低，當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，原花青素得率達(dá)到最大值，即提取效果最好，若繼續(xù)提高料液比，提取出的原花青素溶液濃度會(huì)變低，造成原花青素得率降低，并且會(huì)浪費(fèi)提取溶劑，故1∶30（g/mL）為最佳料液比.

圖3 料液比對(duì)蔓越莓中原花青素提取率的影響

3.4 乙醇濃度對(duì)蔓越莓中原花青素提取效果的影響

從圖4 可以看出，當(dāng)乙醇濃度增加時(shí)，所得原花青素的得率先升高后降低.當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，原花青素得率為最大值，如果繼續(xù)增加乙醇的濃度，高濃度的乙醇可能會(huì)破壞原花青素分子.一定濃度的水進(jìn)入植物的細(xì)胞之中會(huì)將有效成分提取出來(lái)，但非結(jié)合水的量太多，能溶于其中的雜質(zhì)也會(huì)越多，這些雜質(zhì)會(huì)對(duì)原花青素的提取造成干擾［11］，故50%濃度的乙醇為最適濃度.

圖4 乙醇濃度對(duì)蔓越莓中原花青素提取率的影響

3.5 超聲波提取蔓越莓原花青素條件優(yōu)化

以4個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果為前提條件，開展L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2.

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2 中的結(jié)果可知，4 個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響順序?yàn)椋毫弦罕?提取溫度>乙醇濃度>提取時(shí)間；蔓越莓中原花青素的最優(yōu)提取工藝為A2B3C1D2，即提取時(shí)間40 min，提取溫度70℃，料液比1∶20，乙醇濃度50%.

3.6 蔓越莓原花青素抗氧化、還原能力測(cè)試

3.6.1 雙氧水（H2O2）對(duì)蔓越莓原花青素的影響

從圖5 可以看出，在低濃度時(shí)雙氧水的氧化性對(duì)于蔓越莓原花青素結(jié)構(gòu)的破壞作用并不明顯，當(dāng)向原花青素溶液中加入2.0%濃度的雙氧水時(shí)，原花青素含量仍為9.10%，說(shuō)明蔓越莓原花青素對(duì)雙氧水的氧化性有一定的抵抗力.

圖5 H2O2對(duì)蔓越莓原花青素抗氧化性的影響

3.6.2 過硫酸鉀（K2S2O8）對(duì)蔓越莓原花青素的影響

從圖6可以看出，過硫酸鉀的氧化性對(duì)于蔓越莓原花青素的破壞作用并不明顯，當(dāng)向原花青素溶液中添加2.0%濃度的過硫酸鉀時(shí)，原花青素含量仍為8.87%，說(shuō)明蔓越莓原花青素對(duì)過硫酸鉀的氧化性有一定的抵抗力.

圖6 K2S2O8對(duì)蔓越莓原花青素抗氧化性的影響

3.6.3 硫酸亞鐵（FeSO4）對(duì)蔓越莓原花青素的影響

由圖7可得知，當(dāng)加入過硫酸鉀的濃度低于0.5%時(shí)，對(duì)蔓越莓原花青素結(jié)構(gòu)的破壞作用并不明顯，但是超過0.5%時(shí)就會(huì)明顯的造成蔓越莓原花青素結(jié)構(gòu)的破壞，當(dāng)向原花青素提取液中加入2.0%濃度的硫酸亞鐵時(shí)，原花青素含量?jī)H為0.02%，說(shuō)明蔓越莓原花青素對(duì)還原劑硫酸亞鐵抵抗力較弱.

圖7 FeSO4對(duì)蔓越莓原花青素抗氧化性的影響

3.6.4 硼氫化鈉（NaBH4）對(duì)蔓越莓原花青素的影響

從圖8可以看出，還原劑硼氫化鈉對(duì)蔓越莓原花青素有較大的破壞作用，硼氫化鈉的濃度為0.5%時(shí)，原花青素含量?jī)H為2.23%，說(shuō)明蔓越莓原花青素對(duì)還原劑硼氫化鈉完全沒有抵抗力.

圖8 NaBH4對(duì)蔓越莓原花青素抗氧化性的影響

4 結(jié)論

本研究以蔓越莓為原料，利用安全并對(duì)環(huán)境友好的超聲波輔助提取法提取蔓越莓中原花青素，考察了提取時(shí)間、提取溫度、料液比，乙醇濃度4 個(gè)因素對(duì)于原花青素提取率的影響，并通過正交試驗(yàn)對(duì)其提取進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳提取條件為：提取時(shí)間40 min，提取溫度70℃，料液比1∶20，乙醇濃度50%，該條件下，原花青素的提取率為11.65%.通過蔓越莓中原花青素抗氧化還原實(shí)驗(yàn)研究表明：蔓越莓中原花青素對(duì)氧化劑的氧化性有一定的抵抗力，具有較好的抗氧化性；對(duì)于還原劑的還原性抵抗能力極弱，0.5%濃度的還原劑即可明顯破壞蔓越莓中原花青素的結(jié)構(gòu).