丁 濤， 靳寶林， 楊曉宇, 白林含

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都610064)

芽孢桿菌作為益生菌用于生產(chǎn)發(fā)酵食品和保存食品已有很多年的歷史.因其具有分泌蛋白酶、抗菌物質(zhì)的能力以及在胃腸道環(huán)境下較強(qiáng)的生存能力，得到越來(lái)越多的關(guān)注[1].芽孢桿菌是一種外源性的芽孢形成細(xì)菌，通常不能定植于胃腸道中，但可保持胃腸道微生物的良好平衡以及改善動(dòng)物的生產(chǎn)性能[2].已有研究表明益生芽孢桿菌可以在胃腸道的生理?yè)p傷條件下起預(yù)防作用[3],同時(shí)因產(chǎn)生胞外多糖而具有體外清除自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力和體內(nèi)提高抗氧化酶的活性、抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力，還可調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗氧化劑的活性[4].大量從天然發(fā)酵食物中分離出具有益生菌特性的芽孢桿菌，正以多種形式商業(yè)化[5].

微生物胞外多糖是具有糖苷鍵的高分子量聚合物的大分子.多種微生物包括細(xì)菌、真菌、藻類均能在其生長(zhǎng)過(guò)程中分泌胞外多糖，相比而言細(xì)菌產(chǎn)生能力較強(qiáng).胞外多糖不僅具有抗氧化活性，還具有特殊的生理活性，如降低膽固醇、抗腫瘤和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力等，是功能性保健產(chǎn)品和醫(yī)藥產(chǎn)品的重要成分[6].微生物胞外多糖還可能在調(diào)節(jié)腸道菌群中起重要作用，如雙歧桿菌的應(yīng)用[7].

本實(shí)驗(yàn)室從四川懷遠(yuǎn)發(fā)酵米糕作坊環(huán)境中分離純化了多株芽孢桿菌，對(duì)其中高產(chǎn)胞外多糖和乳酸的XQ進(jìn)行分子鑒定、功能鑒定及模擬胃腸道的耐受性試驗(yàn)以及菌株安全性方面探究，為開(kāi)發(fā)益生菌提供新的資源菌株.

2 材料與方法

2.1 材 料

菌株(XQ)，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；L-乳酸，購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司；血瓊脂平板，購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門(mén)氏菌由四川大學(xué)王紅寧教授實(shí)驗(yàn)室提供；OXOID藥敏紙片購(gòu)自Thermo Scientific公司.貨號(hào)分別為CT0024B、CT0041B、CT0425B、CT0020B、CT0058B、CT0013B、CT0264B、 CT0052B、 CT1754B.

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 16S rDNA鑒定 采用M13的通用引物：M13F: 5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′；M13R: 5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′.進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，由成都擎科公司進(jìn)行測(cè)序.將測(cè)序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast上進(jìn)行序列比對(duì)分析，在MEGA 6.06軟件中采用Likelihood方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù).

2.2.2 產(chǎn)乳酸檢測(cè) 將XQ接種至50 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)48 h.發(fā)酵液中乳酸含量的測(cè)定參照付衛(wèi)明等人的反相高效液相色譜法[8].色譜條件：柱子為C-18反相柱子；流動(dòng)相為pH2.5磷酸緩沖液；柱溫為室溫；流速為1 mL/min；波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣量為20 μL；L-乳酸為內(nèi)標(biāo).

2.2.3 胞外多糖的粗提取 將XQ接種至100 mL產(chǎn)胞外多糖液體培養(yǎng)基中，接種量為3%，37 ℃ 200 r/min發(fā)酵3 d.參照王輯[9]的方法對(duì)發(fā)酵液中的胞外多糖進(jìn)行粗提取，并采用苯酚-硫酸法[10]測(cè)定粗胞外多糖的含量.

2.2.4 胞外多糖的純化 取粗胞外多糖溶液在純水中透析(透析袋MWCO為3 000～7 000)，上樣DEAE(GE XK16)中，離子水、0.1 mol/mL、0.3 mol/mL、0.5 mol/mL NaCl溶液分階段洗脫，每階段洗脫3個(gè)柱體積，流速為1 mL/min，分體積收集洗脫液(3 mL/管)，用苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖洗脫液含量，以各管在490 nm的吸光光度測(cè)定對(duì)應(yīng)管數(shù)作圖，繪制其洗脫曲線.合并各個(gè)洗脫峰的洗脫液，利用超濾管(MWCO3000)濃縮，在純水中透析.

2.2.5 體外抑菌實(shí)驗(yàn)[11]將XQ接種至50 mL LB液體培養(yǎng)基中，接種量為2%，30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)3 d.將發(fā)酵液上清液冷凍干燥后，稀釋20倍后過(guò)濾，得到濃縮的無(wú)菌發(fā)酵濾液，吸取50 μL浸潤(rùn)空白濾紙片；粗胞外多糖吸取50 μL浸潤(rùn)空白濾紙片.

將大腸桿菌、腸炎沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌活化12 h均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上；后將上述濾紙片放置于LB平板上.其中，無(wú)菌LB培養(yǎng)液的濾紙片為空白對(duì)照，氯霉素(30 μg)藥敏紙片為陽(yáng)性對(duì)照.每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，觀察濾紙片周圍的抑菌圈.

2.2.6 羥自由基清除活性 羥自由基清除活性的測(cè)定參照金鳴等人[12]的方法.

羥自由基清除活性=(A1-A0)/

(A-A0)×100%

式中，A0是對(duì)照試驗(yàn)的吸光光度值(即以水代替樣品)；A1是樣品試驗(yàn)的吸光光度值；A是以水替代反應(yīng)體系中的H2O2和樣品的吸光度值.

2.2.7 DPPH自由基清除活性DPPH自由基清除活性的測(cè)定參照Shimada等人[13]的方法測(cè)定.

羥自由基清除活性=[1-(A1-A)]/

A0×100%

式中，A0是對(duì)照試驗(yàn)的吸光光度值(即以水代替樣品);A1是樣品試驗(yàn)的吸光光度值;A是以水替代反應(yīng)體系中的DPPH溶液的吸光度值.

2.2.8 抗腫瘤活性測(cè)定 采用 Ramamoorthy等人[14]的方法測(cè)定胞外多糖的抗腫瘤活性.選擇A549和HepG2細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)對(duì)象，細(xì)胞在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培育24 h后，在A549、HepG2中分別加入終濃度為4和6 mg/mL的胞外多糖，在空白對(duì)照中加入等體積的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后；采用CCK-8法[15]體外檢測(cè)細(xì)胞活性.

生長(zhǎng)抑制率=(1-A1/A0)×100%

式中，A0是對(duì)照試驗(yàn)的吸光光度值(即以培養(yǎng)基代替樣品)；A1是樣品試驗(yàn)的吸光光度值.

2.2.9 耐受性實(shí)驗(yàn) 采用Maragkoudakis等人[16]的方法進(jìn)行人工模擬胃腸道耐受性和膽鹽耐受性實(shí)驗(yàn).

相對(duì)存活率=A1/A0×100%

式中，A0是未處理(0 h)的活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值；A1是處理后的活菌數(shù)的對(duì)數(shù)值.

2.2.10 藥敏實(shí)驗(yàn) 將XQ用棉簽均勻涂布于MH瓊脂表面，將涂布后的平板在室溫下干燥3～5 min，用無(wú)菌鑷子將藥敏紙片貼于MH瓊脂表面，使紙片與瓊脂完全接觸.每種藥敏紙片設(shè)置3個(gè)重復(fù).將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h.實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)CLSL分析[17].

2.2.11 溶血實(shí)驗(yàn) 將XQ均勻涂布到血瓊脂平板上，37 ℃孵育24 h，檢測(cè)溶血情況[18].

2.2.12 數(shù)據(jù)分析 使用EXCEL統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并利用Prism 6進(jìn)行作圖.試驗(yàn)數(shù)據(jù)SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Ducan法進(jìn)行單因素方差分析.

3 結(jié)果與分析

3.1 分子鑒定

將XQ的16S rDNA序列分別與NCBI中的GenBank中收錄的序列進(jìn)行BLAST分析，利用MEGA 6軟件的Likelihood方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖1.XQ與短小芽孢桿菌Bacilluspumilusstrain BDH8(序列登錄號(hào)：KF933629.1)相似性為99.62%.

圖1 XQ 16 S rDNA聚類分析Fig.1 16 S rDNA cluster analysis of XQ

3.2 HPLC檢測(cè)乳酸含量

根據(jù)乳酸HPLC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，乳酸的保留時(shí)間為10.6 min，以乳酸濃度為橫坐標(biāo)(X軸)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y軸)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程為y=350 038.700 7x+1 056 828.801 1,R2=0.99,在0～35 g/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(見(jiàn)圖2).

圖3(a)，乳酸溶液出峰時(shí)間為10.632 min，圖3(b)發(fā)酵液中的乳酸出峰時(shí)間10.616 min，圖3(c) 6 mg/mL乳酸溶液與發(fā)酵液混合液中的出峰時(shí)間為10.119 min，在發(fā)酵液中添加乳酸發(fā)現(xiàn)其峰升高(相較于發(fā)酵液)，說(shuō)明XQ產(chǎn)乳酸.檢測(cè)其發(fā)酵液中乳酸，計(jì)算得到其峰面積為3 859 147，帶入公式，其發(fā)酵液中乳酸含量為8 mg/mL.

圖2 乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of lactic acid

圖3 HPLC 檢測(cè)乳酸

3.3 胞外多糖含量測(cè)定

以葡萄糖濃度做橫坐標(biāo)(X軸)，吸光度A490 nm做縱坐標(biāo)(Y軸)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.913x+0.013 6，R2=0.99，在0～1.4 mg/mL范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系(見(jiàn)圖4).利用苯酚-硫酸法測(cè)定發(fā)酵液中粗胞外多糖，將其稀釋40倍，重復(fù)3次測(cè)定平均吸光光度值為0.356，則帶入公式XQ產(chǎn)粗胞外多糖的濃度為7.16 mg/mL.

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of glucose

流速為1 mL/min時(shí)，僅有去離子水、0.1 mol/L NaCl水溶液中有多糖存在.其洗脫峰為圖5，DEAE將粗胞外多糖分為E1和E2兩個(gè)峰.由于DEAE是通過(guò)多糖組分中帶有的電荷來(lái)篩分多糖，因酸性多糖比中性多糖所帶電荷多，所以采用NaCl濃度梯度梯度增大的方式進(jìn)行洗脫進(jìn)而分離酸性多糖[10].E1組分不與DEAE結(jié)合，推測(cè)為中性多糖；E2與DEAE結(jié)合，可通過(guò)NaCl洗脫，帶有電荷，推測(cè)為酸性多糖.

圖5 胞外多糖DEAE層析洗脫曲線

3.5 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

圖6可以看出，XQ發(fā)酵液僅對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌有抑制效果，粗胞外多糖對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制效果，且對(duì)大腸桿菌抑制效果最強(qiáng)，對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌抑制作用最弱.

圖6 抑菌實(shí)驗(yàn)

3.6 胞外多糖的抗氧化活性

3.6.1 羥自由基清除活性 胞外多糖E1、E2的羥自由基清除活性結(jié)果見(jiàn)圖7(a).羥自由基清除活性隨著濃度升高而增加，且E2顯著高于E1；在濃度為10 mg/mL時(shí)，E1和E2其羥自由基清除率為3.24%和84.58%.

3.6.2 DPPH自由基清除活性 胞外多糖E1、E2的DPPH自由基的清除活性的結(jié)果見(jiàn)圖7(b).清除活性隨著濃度的增加而增加.在濃度為10 mg/mL時(shí)，E1和E2的DPPH自由基的清除率為26.07%和47.03%，具有中等的DPPH自由基清除活性.

圖7 胞外多糖的抗氧化性

3.7 抗腫瘤活性

在本試驗(yàn)中，通過(guò)CCK-8的方法測(cè)定了胞外多糖對(duì)A549和HepG2細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒性試驗(yàn).加入胞外多糖濃度為4 mg/mL時(shí)，E2對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為81.30%，培養(yǎng)HepG2細(xì)胞時(shí)加入胞外多糖濃度為6 mg/mL，E2對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為53.40%.胞外多糖E2對(duì)癌細(xì)胞系A(chǔ)549和HepG2細(xì)胞具有潛在的細(xì)胞毒性試驗(yàn).E1未顯示抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用.

3.8 耐受性實(shí)驗(yàn)

XQ具有良好的耐受性，在酸性、胃蛋白酶、胰蛋白酶和膽鹽特定條件下3 h相對(duì)存活率分別為82.51%、82.6%、89.15%和72.09%.

圖9 XQ耐受性實(shí)驗(yàn)Fig.9 Tolerance experiment of XQ

3.9 藥敏實(shí)驗(yàn)

根據(jù)抑菌圈直徑的大小判斷敏感性高低.由表1可知XQ作為格蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌抗生素(慶大霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、氯霉素)均敏感；對(duì)革蘭氏陰性菌抗生素氨曲南不敏感.說(shuō)明XQ幾乎沒(méi)有潛在的藥物抗性基因，在應(yīng)用于生產(chǎn)中具有安全性.

表1 XQ藥敏實(shí)驗(yàn)

3.10 溶血實(shí)驗(yàn)

溶血性是其致病性的一個(gè)外在表現(xiàn)形式，是衡量毒力的重要指標(biāo).見(jiàn)圖10，XQ不溶血，對(duì)照組為粘質(zhì)沙雷氏菌溶血，說(shuō)明XQ在溶血性方面具有安全性.

圖10 溶血實(shí)驗(yàn)Fig.10 Hemolysis test

在食品相關(guān)領(lǐng)域，益生菌用于食品是全球趨勢(shì)，其主要應(yīng)用于提供一些除傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)元素外的其它可促進(jìn)健康的成分.但如何篩選和評(píng)估益生菌的價(jià)值是業(yè)內(nèi)學(xué)者一直在探索的問(wèn)題[19].而益生菌在體內(nèi)共生環(huán)境下，通過(guò)分泌相關(guān)的代謝產(chǎn)物改變?nèi)梭w局部的條件而產(chǎn)生利好有初步的研究和認(rèn)識(shí)，如有機(jī)酸或多糖等物質(zhì).

由于大多數(shù)病原體不能在低pH值下生長(zhǎng)[20].有機(jī)酸的分泌，如乳酸，可降低胃腸道的pH使其成為不利于病原體生長(zhǎng)的環(huán)境，同時(shí)有機(jī)酸對(duì)病原菌的代謝和毒素的產(chǎn)生也有影響，進(jìn)而起到預(yù)防疾病的作用[21].

胞外多糖具有多種生理功能，但天然胞外多糖的產(chǎn)量并不高.與動(dòng)植物胞外多糖相比微生物胞外多糖具有很多優(yōu)點(diǎn)，其生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)、地理和環(huán)境因素的影響，且原料豐富，成本相對(duì)較低，可在人工控制的條件下進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，其產(chǎn)量也相對(duì)較高，因此微生物胞外多糖具有很強(qiáng)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力和廣闊的前景發(fā)展[22].

現(xiàn)有研究中大部分乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量偏低(低于1g/L)[23-24]，Lactobacillussp. Ca6產(chǎn)胞外多糖最大產(chǎn)量為2.4 mg/mL[25]，而我們篩選的這株乳酸芽孢桿菌XQ胞外多糖產(chǎn)量為7.16 mg/mL，可節(jié)省高昂純化成本，因此XQ是具有開(kāi)發(fā)優(yōu)勢(shì)的.有報(bào)道稱來(lái)自不同微生物的胞外多糖混合物具有更好的DPPH清除能力[26-27]，這一點(diǎn)可為今后配制更好的DPPH清除能力胞外多糖混合物提供組分來(lái)源.

胞外多糖的抗腫瘤活性也備受關(guān)注.在本研究中，E2對(duì)癌細(xì)胞系A(chǔ)549和HepG2細(xì)胞具有細(xì)胞毒性.濃度為4 mg/mL時(shí)，對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為81.30%，濃度為6 mg/mL，對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為53.40%.

E1未表現(xiàn)出腫瘤抑制作用，但作為中性多糖依然具有重要價(jià)值.Speciale等人[28]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌雙歧桿菌PRI1可產(chǎn)生四種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的中性多糖混合物，同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的中性多糖在調(diào)節(jié)宿主與細(xì)菌相互作用中具有不同的作用，推測(cè)中性多糖混合物可根據(jù)結(jié)構(gòu)差異調(diào)節(jié)宿主免疫力，從而增強(qiáng)免疫力或誘導(dǎo)免疫耐受.中性多糖可以促進(jìn)某些乳酸菌的生長(zhǎng).Zeng等人[29]從CistanchedeserticolaYC Ma獲得了中性多糖CDA-0.05，可以顯著促進(jìn)三種擬桿菌(B.thetaiotaomicron，B.ovatus和B.fragilis)的生長(zhǎng)；此外，CDA-0.05還可以促進(jìn)某些益生菌的生長(zhǎng)，例如干酪乳桿菌，植物乳桿菌和路透乳桿菌.中性多糖可能還具有抗病毒的作用.Li等人[30]從DendrobiumnobileLindl分離出的中性多糖DNPE6(4)，具有抗TMV和抗CMV活性.

綜上，從四川懷遠(yuǎn)發(fā)酵米糕作坊環(huán)境中分離出的短小芽孢桿菌(XQ)，高產(chǎn)胞外多糖及乳酸.對(duì)常見(jiàn)食源性病原菌沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌具有抑制作用；產(chǎn)生的胞外多糖具備羥自由基清除活性和DPPH自由基的清除活性，并能抑制腫瘤生長(zhǎng).在模擬胃腸道耐受性實(shí)驗(yàn)中對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶和膽鹽均具有良好耐受性.對(duì)常用抗生素?zé)o耐藥性，溶血試驗(yàn)陰性，具有生物安全性.表明XQ可作為一種潛在的益生菌.