董照陽，胡欣欣，陳茜，魏偉

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）屬于糖尿病常見的微血管病變，也是主要的致盲原因。玻璃體腔內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）藥物已在臨床上廣泛使用。雖然抗VEGF藥物在DR的治療中取得了不錯的效果，但是也存在術(shù)后不良反應的現(xiàn)象[1]。芪明顆粒由成都中醫(yī)藥大學研制而成，利用現(xiàn)代工藝制藥，在DR治療中廣泛應用。該方由8味中藥組成，主要作用包括滋養(yǎng)肝腎、益氣生津、通絡明目。根據(jù)目前臨床觀察和實驗研究，都未能精準明確地指出芪明顆粒治療DR 的有效活性成分、作用靶點和作用機制。網(wǎng)絡藥理學是在系統(tǒng)生物學和藥理學相關(guān)方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，從“多成分-多靶點-多途徑”系統(tǒng)地研究中藥與機體之間的作用機制，在研究中藥藥效作用中被廣泛應用[2]。本次研究擬用網(wǎng)絡藥理學方法，對芪明顆粒治療DR 作用機制進行探討和研究，為臨床應用提供科學的參考。

1 對象與方法

1.1 芪明顆粒相關(guān)活性成分和藥物靶點的篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫分別收集黃芪、葛根、熟地黃、枸杞子、決明子、蒲黃、茺蔚子、水蛭8 味中藥的化學成分，以口服吸收利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和成藥性（drug like index，DL）≥0.18 為條件篩選作為篩選參數(shù)，記錄成分的編號和名稱。再通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫搜索候選化合物相關(guān)的潛在靶點，并應用UniProt 數(shù)據(jù)庫檢索上述靶點名稱，確認人源靶點，獲得靶點對應的基因名。

1.2 DR潛在作用靶點的篩選

GeneCards 數(shù)據(jù)庫是一個集成大量web 源的以基因為中心的數(shù)據(jù)庫，它可通過Gifts算法來計算靶點與疾病之間的相關(guān)度，本研究以相關(guān)性分數(shù)（Relevance score≥10）作為篩選條件；OMIM 數(shù)據(jù)庫是用于描述人類遺傳病以及基因研究的知識庫。本研究通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫檢索，以“diabetic retinopathy”為關(guān)鍵詞進行搜索，獲得與DR 相關(guān)的靶點。

1.3 化合物-靶點網(wǎng)絡和蛋白相互作用網(wǎng)絡圖的構(gòu)建與分析

將藥物的成分靶點與DR 靶點取交集，得到芪明顆粒治療DR的潛在作用靶點，并上傳至Venny平臺繪制圖形。將有效化合物與其對應靶點數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.2軟件，繪制化合物-靶點網(wǎng)絡圖，并通過Network Analyzer 插件進行拓撲分析[3]。網(wǎng)絡中成分和靶點用節(jié)點表示，成分與靶點之間的相互作用用邊表示。將上述作用靶點結(jié)果輸入到STRING 數(shù)據(jù)庫中，選擇“multiple proteins”模式，蛋白種屬設(shè)為“Homo sapiens”，設(shè)定置信度為0.9，保存結(jié)果為TSV格式文件。然后使用Cytoscape 構(gòu)建蛋白相互作用（the protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡并進行拓撲分析，根據(jù)中心度值（betweenness centrality，BC）、親中心度值（closeness centrality，CC）和等級值（degree centrality，DC）篩選核心作用靶點，獲得蛋白相互網(wǎng)絡圖。

1.4 基因本體富集分析和京都基因與基因組百科全書的通路分析

為了進一步了解上述靶標蛋白基因的功能以及在信號通路中的作用，將篩選得到的芪明顆粒作用的靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫，設(shè)定閾值P＜0.05，分別進行基因本體（gene ontology，GO）生物學過程富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析，從而分析藥物治療DR 靶點的主要生物學過程和代謝通路，并繪制柱狀圖和表格進行可視化分析。

1.5 分子對接驗證

利用PDB 數(shù)據(jù)庫查詢主要核心作用靶點的蛋白結(jié)構(gòu)，導入SwissDock 在線對接分析對接服務器，獲得對接評分，以評價芪明顆粒關(guān)鍵化學成分與關(guān)鍵靶點之間的對接效果。

2 結(jié)果

2.1 活性成分和靶點的篩選

通過TCMSP 篩選和查閱文獻得到活性化合物數(shù)目分別為黃芪20個，葛根4個，枸杞子45個，決明子14個，蒲黃8個，茺蔚子0個，水蛭0個，去除重復后，芪明顆粒共有活性成分81 個。收集TCMSP 數(shù)據(jù)庫（UniProt 統(tǒng)一命名）和Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫內(nèi)中藥所有靶點，經(jīng)過篩選并刪除重復，整合得到作用靶點299個。

2.2 疾病靶點的篩選

經(jīng)GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索“diabetic retinopathy”獲得相關(guān)的疾病靶點3473 個，選取相關(guān)度＞10 的靶點共770個。OMIM數(shù)據(jù)庫檢索獲得相關(guān)的疾病靶點216 個。去除2 個數(shù)據(jù)庫重復值，最終得到914 個治療DR 的靶點。將疾病靶點與藥物成分靶點輸入Venny 軟件繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得疾病靶點-藥物成分共同靶點91個（圖1）。

圖1 芪明顆粒成分靶點和DR靶點韋恩圖

2.3 化合物-疾病靶點相互作用網(wǎng)絡圖及拓撲分析

通過Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建芪明顆粒治療DR化合物一靶點相互作用網(wǎng)絡圖，繪制活性成分和靶點網(wǎng)絡（圖2）。從圖中可看出同一活性成分可作用于不同靶點，不同活性成分也可作用于同一靶點，由此可見，芪明顆粒多成分和多靶點的特點。通過Network Analyzer 對化合物-靶點圖進行拓撲學分析，選取中心度值、親中心度值和等級值均大于中位數(shù)的核心靶點和關(guān)鍵有效化合物。研究共篩選出關(guān)鍵活性成分21 種，主要為槲皮素、山奈酚、水蛭素、異鼠李素、毛異黃酮、黃豆黃素、7-O-甲基異丙醇胺、3'-甲氧基大豆苷元，花生四烯酸，beta-谷甾醇等（表1）。

表1 芪明顆粒關(guān)鍵化合物

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

將韋恩圖中成分和疾病共有潛在靶點導入STRING 中，獲得蛋白相互作用，保存其TSV 格式文件。將獲取蛋白互作信息導入Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡拓撲學分析得到芪明顆粒對DR作用靶點蛋白互作網(wǎng)絡。中心度值、親中心度值和等級值均大于中位數(shù)的靶點分別為信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、白細胞介素6（interleukin 6，IL6）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1）、酪氨酸蛋白激酶（sarcoma gene，Src）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、趨化因子（C-X-C 基序）配體8（Interleukin-8，CXCL8）、表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、白細胞介素1B（interleukin 1B，IL-1B）、和表皮細胞生長因子（Epidermal Growth Factor，EGF）等。這說明這些靶點是蛋白互作網(wǎng)絡中的核心靶點，在網(wǎng)絡中具有重要作用（圖3）。

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡圖

2.5 芪明顆粒干預DR的GO富集分析和KEGG富集分析

通過數(shù)據(jù)庫DAVID進行的GO功能富集分析得到128 個（P＜0.05）條目。生物過程條目85 個，主要涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、血管生成的正調(diào)控、細胞對脂多糖的反應、對缺氧的反應、內(nèi)皮細胞凋亡過程的負調(diào)控、炎癥反應和免疫反應等；分子功能條目23 個，主要涉及細胞因子活性、生長因子活性、MAP激酶活性、DNA結(jié)合等；細胞組成條目20個，主要涉及細胞外間隙、質(zhì)膜和質(zhì)膜的外側(cè)、胞質(zhì)溶膠、線粒體等。繪制3 個模塊條形圖（圖4、5、6）。KEGG通路富集分析得到96條（P＜0.05）信號通路，主要涉及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）信號通路、T細胞受體（T-cell receptor，TCR）信號通路、VEGF信號通路、雌激素信號通路、MAPK信號通路、脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol3-kinase/proteinkinaseB，PI3K/Akt）和核因子kappa B（nuclear factor kappa-B，NF-kB）信號通路等。這表明芪明顆粒的有效成分可能通過作用于這些信號通路來達到治療DR目的（表2）。

圖4 芪明顆粒干預DR的生物學過程分析圖

表2 芪明顆粒治療DR關(guān)鍵靶點參與的通路富集信息

2.6 分子對接驗證

在蛋白互作網(wǎng)絡中，將degree 值最高的前5 位關(guān)鍵化學成分與5 個關(guān)鍵靶點分輸入至SwissDock進行分子對接驗證（表3），蛋白質(zhì)與小分子結(jié)合越緊密，F(xiàn)ull Fitness 值越低。成分總分結(jié)果顯示，F(xiàn)ull Fitness 值較低的依次為槲皮素、山柰酚、水蛭素、異鼠李素、毛異黃酮等。選擇山柰酚與STAT3、JUN、Src、IL6、AKT1 進行對接，結(jié)果顯示山柰酚與靶點蛋白有較好的結(jié)合活性，并且分子構(gòu)象結(jié)合穩(wěn)定（圖7）。

圖7 山奈酚與靶蛋白分子對接圖

表3 分子對接結(jié)果

圖5 芪明顆粒干預DR的細胞組成分析圖

圖6 芪明顆粒干預DR的分子功能分析圖

3 討論

中醫(yī)認為DR 屬于“血灌瞳神”“視瞻昏渺”“螢星滿目”“暴盲”“消渴目病”等范疇[4]。趙艷青等[5]認為，本病的病機為肝腎虧虛，氣陰兩虛；目絡阻滯，痰瘀互結(jié)。中醫(yī)藥用于對DR 的臨床研究越來越受到眼科醫(yī)生和監(jiān)管部門的高度關(guān)注[6-7]。芪明顆粒方中黃芪益氣生血、通調(diào)血脈，為君藥；葛根生津止渴，通調(diào)血脈，枸杞子滋補肝腎、養(yǎng)精益血，共為臣藥；決明子、茺蔚子、蒲黃、水蛭等活血化瘀、利水消腫、滋肝補腎，共為使藥。諸藥合用共奏滋養(yǎng)肝腎、益氣生津、通絡明目之效。

DR 的發(fā)病機制與氧化應激、缺氧、炎癥反應等密切相關(guān)。依據(jù)黃酮類化合物的多種生理活性，近年來大量研究[8]表明，黃酮類化合物對DR有顯著的干預作用。本研究通過藥物-化合物-靶點網(wǎng)絡分析，發(fā)現(xiàn)了21個關(guān)鍵活性化合物。其中，槲皮素屬于黃酮類化合物，具有強大的抗氧化、抗炎和抗糖尿病的功效[8]，通過抑制NF-κB 和促進半胱天冬酶-3（Caspase-3）活性發(fā)揮抗ARPE-19 細胞凋亡的作用，抑制ARPE-19細胞高糖誘發(fā)的損傷[9]。山奈酚屬于黃酮醇類化合物，具有抗氧化、抗凋亡和抗炎性質(zhì)等多種藥理作用[10-11]，通過促進細胞外調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulatory protein kinase，ERK）和血管生成抑制蛋白1（vasohibin-1，VASH1）信號傳導保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞免受高糖誘導的損傷[12]。水蛭素是一種特異性凝血酶抑制劑，在心腦血管疾病、外科深靜脈血栓、腫瘤、關(guān)節(jié)炎、外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病等方面并取得了很好的療效[13]，有相關(guān)研究表明，水蛭素通過抑制STAT3 信號通路，抑制人腎小管上皮細胞纖維化的作用[14]。異鼠李素屬于黃芪總黃酮的成分之一，具有內(nèi)皮保護作用、抗血小板凝集、抗氧化等多種藥理作用[15]。PPI 網(wǎng)絡表明芪明顆粒多靶點抗DR 的作用特點，網(wǎng)絡中STAT3、JUN、SRC、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK14、CXCL8、EGFR、MAPK8、IL-1B、FOS 和EGF 等14 個靶點作用較強。IL-1B 和IL6 可引起白細胞聚集，炎癥反應，與DR 的發(fā)展關(guān)系密切，其中IL6 通過上調(diào)VEGF 達促使新生血管形成并增加血管通透性[16]。MAPK1、MAPK8和MAPK14都是MAPK激酶家族的一員，主要參與細胞增殖、生長和分化等過程[17-19]，其中MAPK8 在細胞生存、細胞死亡、炎癥及其他病理過程中也起著重要的調(diào)控作用。

為了進一步說明靶蛋白在基因功能和信號通路中的作用，本研究進行了GO 功能富集和KEGG通路富集分析。GO 功能富集結(jié)果顯示，芪明顆粒治療DR 與RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、血管生成的正調(diào)控、細胞對脂多糖的反應、炎癥反應、免疫反應、內(nèi)皮細胞凋亡過程的負調(diào)控和對缺氧的反應等生物過程相關(guān)。由KEGG通路富集分析可知，芪明顆粒治療DR主要通路有TNF信號通路、HIF-1信號通路、癌癥通路、VEGF 信號通路、PI3K/Akt 信號通路、MAPK 信號通路和NF-κB 信號通路等。DR 是視網(wǎng)膜長期處于缺血缺氧狀態(tài)，繼而誘導VEGF 表達上調(diào)，促進PDR患者視網(wǎng)膜新生血管的形成[20]，可激活下游PI3K/AKT 通路，可加速內(nèi)皮細胞發(fā)生遷移、增殖，形成新生微血管腔，最終形成穩(wěn)定的血管[21]。TNF-α是炎癥反應中具有代表性的炎癥因子，通過作用于血管內(nèi)皮細胞上的受體，激活NF-κB信號，引起視網(wǎng)膜毛細血管細胞凋亡，血管通透性增加，破壞血-視網(wǎng)膜屏障，促進DR 的發(fā)生發(fā)展[22]。HIF-1α是細胞內(nèi)重要的缺氧信號蛋白，在高血糖和缺血缺氧狀態(tài)下，誘導HIF-1α的表達上調(diào)，其下游重要的靶基因VEGF 也隨之上調(diào)[23]，進而調(diào)控血管增生。以上諸條通路涉及到炎癥反應、細胞凋亡、氧化應激等，基于此推測芪明顆粒中的活性成分主要通過調(diào)控上述多條通路來發(fā)揮治療DR的作用。

通過分子對接驗證和靶點蛋白互作網(wǎng)絡圖，本研究認為STAT3、JUN、SRC、IL6、AKT1、VEGFA、MAPK1、MAPK14、CXCL8、EGFR、MAPK8 和IL-1B等為核心治療靶點，可被多個有效化合物作用，并對多個靶點產(chǎn)生相互影響，表明芪明顆粒對DR 有直接或間接的治療作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接的方法，芪明顆?？赏ㄟ^“多靶點-多途徑”治療DR，為芪明顆粒進一步深入探討提供了一定的科學依據(jù)，同時也為中醫(yī)藥臨床和實驗的研究提供了新方法和新思路。當然，本研究的結(jié)論仍存在局限性，只是通過挖掘數(shù)據(jù)對芪明顆粒治療DR 的藥效機制進行預測，尚需要基礎(chǔ)和臨床藥理試驗進一步驗證。