何昭華，梁文旺，鐘茜

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是導(dǎo)致成年人視力喪失的主要原因之一，而高血糖被認(rèn)為是DR 的主要致病因素，并與視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激增加有關(guān)[1]。白楊素（chrysin）是一種天然的黃酮類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤特性，其對(duì)小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[2]。白楊素與黃芩苷聯(lián)用對(duì)腎小管損傷、腎功能紊亂具有改善作用[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNAs）是長(zhǎng)度超過(guò)200 nt、蛋白編碼潛力缺失的RNA 轉(zhuǎn)錄本，因其在細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激損傷等生物學(xué)過(guò)程中的作用而受到廣泛關(guān)注。研究顯示[4]，上調(diào)lncRNA 生長(zhǎng)抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5（growth suppression-specific transcript 5，GAS5）表達(dá)可改善脂多糖誘導(dǎo)的軟骨損傷。DR患者外周血中l(wèi)ncRNA GAS5 表達(dá)降低[5]，但白楊素是否調(diào)控lncRNA GAS5 表達(dá)保護(hù)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷并不清楚。本研究以高糖刺激人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs）構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，探討白楊素對(duì)該損傷是否具有保護(hù)作用，分析其機(jī)制是否與調(diào)控lncRNA GAS5 表達(dá)有關(guān)，以期為DR 治療提供有效策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HRMECs 細(xì)胞購(gòu)于上海啟達(dá)生物科技公司；白楊素（純度≥98%，規(guī)格20 mg）購(gòu)于上海源葉生物科技公司；GAS5小干擾RNA（si-GAS5）及其陰性對(duì)照（si-NC）、GAS5 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-GAS5）與其空載體質(zhì)粒（pcDNA）購(gòu)于北京華大六合基因公司；脂質(zhì)體2000（Lipofectamine 2000）購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq II 試劑盒購(gòu)于上海生工生物公司；丙二醛（MDA）含量檢測(cè)試劑盒、超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V（annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購(gòu)于上海貝博生物公司；兔源B 細(xì)胞淋巴瘤-2 蛋白（B cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl 相關(guān)x 蛋白（Bcl associated x protein，Bax）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體以及山羊抗兔IgG購(gòu)于上海碧云天生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染

取1×106個(gè)HRMECs 細(xì)胞接種在24 孔板，當(dāng)細(xì)胞60%匯合時(shí)，利用脂質(zhì)體2000 試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，即將脂質(zhì)體2000（1 μL）和無(wú)血清培養(yǎng)液（50 μL）置于無(wú)菌EP 管中室溫靜置5 min，將轉(zhuǎn)染的RNA（20 pmol 的pcDNA-GAS5 或pcDNA 或si-GAS5 或si-NC）和無(wú)血清培養(yǎng)液（50 μL）置于另一無(wú)菌EP試管中。將上述兩管溶液混合，室溫靜置20 min，得到RNA與脂質(zhì)體復(fù)合物。將混合物加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，37℃+5%CO2條件下轉(zhuǎn)染培養(yǎng)6 h，更換為完全培養(yǎng)基代替，收獲轉(zhuǎn)染48 h細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

正常組（normal group，NG）：用含5.5 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)液孵育HRMECs 48 h。

高糖組（high glucose group，HG）：用含30 mmol/L葡萄糖孵育HRMECs 48 h[6]。

白楊素組（chrysin group，CG）：分為3個(gè)劑量組，白楊素低劑量組（low dose chrysin group，LCG）、白楊素中劑量（medium dose chrysin group，MCG）、白楊素高劑量（high dose chrysin group，HCG）組：用含30 mmol/L葡萄糖和不同濃度白楊素培養(yǎng)液（12.5、25.0、50.0μmol/L）分別孵育HRMECs 48 h[7]。

pcDNA 組、pcDNA-GAS5 組：用含30 mmol/L 葡萄糖培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染pcDNA 或轉(zhuǎn)染pcDNA-GAS5細(xì)胞48 h。

HCG+si-NC組、HCG+si-GAS5組：用含30 mmol/L葡萄糖和50.0 μmol/L 白楊素的培養(yǎng)液孵育轉(zhuǎn)染si-NC或轉(zhuǎn)染si-GAS5細(xì)胞48 h。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 細(xì)胞中MDA 含量以及SOD 活性 收集各組HRMECs 至EP 管，離心后棄上清。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)加入提取液，冰浴、超聲波破碎細(xì)胞，4℃離心機(jī)10000 rpm 離心10 min，收集上清置于冰上。按照各個(gè)試劑盒操作步驟分別測(cè)定MDA 水平、SOD 和GSH-Px活性。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組HRMECs細(xì)胞以1×106個(gè)/孔的密度接種96孔板，分別在孵育24、48、72 h時(shí)間點(diǎn)向各實(shí)驗(yàn)孔加入10 μL的CCK-8工作液，反應(yīng)2 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm 處光密度（OD）值以表示細(xì)胞增殖活力。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，室溫3000 rpm離心5 min，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液重新懸浮細(xì)胞，3000 rpm 離心5～10 min，洗滌后加入300 μL 的結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞。3000 rpm 離心5～10 min，洗滌后加入300 μL 的結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞。加入5 μL的Annexin V-FITC，暗室孵育15 min。再加入5 μL的PI，暗室孵育5 min。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4.4 免疫印記法檢測(cè)Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá) 用放射免疫沉淀試驗(yàn)（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解緩沖液處理HRMECs，收集總蛋白，然后用二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度。采用SDS-PAGE分離細(xì)胞蛋白，隨后使用濕轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。用5%脫脂牛奶在室溫下孵育膜1 h，然后孵育用一抗溶液孵育膜過(guò)夜。次日，用PBS 和Tween-20溶液（PBST）洗滌3次，再用稀釋的二抗溶液孵育膜2 h，然后用PBST 沖洗三次。將膜置于暗盒內(nèi)，加入顯影劑顯影。蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.4.5 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢 測(cè)lncRNA GAS5表達(dá) 采用Trizol 試劑提取各組細(xì)胞的總RNA，取總5 μL RNA 樣本用無(wú)RNA 的超純水稀釋20倍，紫外分光光度法在260 nm和280 nm測(cè)定光密度（OD）值，以確定RNA 的濃度和純度，如果OD260/OD280值在1.7～2.1之間，則認(rèn)為RNA合格可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，根據(jù)SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-qPCR。2-ΔΔCt法計(jì)算lncRNA GAS5表達(dá)量。引物序列如下（表1），實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

表1 RT-qPCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05時(shí)，則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白楊素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs氧化損傷的影響

與NG 組比較，HG 組HRMECs 中GAS5 表達(dá)量降低（t=45.322，P=0.000），細(xì)胞SOD活性降低（t=26.923，P=0.000），MDA含量升高（t=36.123，P=0.000）；與HG組比較，MCG組HRMECs中GAS5表達(dá)量升高（t=17.391，P=0.000），細(xì)胞SOD 活性升高（t=12.231，P=0.000），MDA 含量降低（t=7.510，P=0.002）；與HG 組比較，HCG 組HRMECs 中GAS5 表達(dá)量升高（t=36.363，P=0.000），細(xì)胞SOD 活性升高（t=22.654，P=0.000），MDA 含量降低（t=27.228，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs中GAS5表達(dá)及氧化損傷的影響（，n=3）

表2 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs中GAS5表達(dá)及氧化損傷的影響（，n=3）

注：a 與NG相比，P＜0.05；b 與HG相比，P＜0.05；c 與LCG相比，P＜0.05；d與MCG相比，P＜0.05。NG 正常組；HG 高糖組；LCG 白楊素低劑量組；MCG 白楊素中劑量組；HCG 白楊素高劑量組；Bcl B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白；Bax Bcl相關(guān)x蛋白

2.2 白楊素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs凋亡的影響

與NG 組比較，HG 組HRMECs 中Bax 蛋白表達(dá)量升高（t=24.003，P=0.000），凋亡率升高（t=36.811，P=0.000），Bcl-2蛋白表達(dá)量降低（t=27.391，P=0.000），細(xì)胞活力（48 h、72 h）降低（t48h=9.507，P=0.001；t72h=16.089，P=0.000）；與HG 組比較，MCG 組HRMECs中Bax蛋白表達(dá)量降低（t=8.943，P=0.001），凋亡率降低（t=8.896，P=0.001），Bcl-2蛋白表達(dá)量升高（t=8.593，P=0.001），細(xì)胞活力（48h、72h）升高（t48h=4.406，P=0.012；t72h=6.689，P=0.003）；與HG 組比較，HCG 組HRMECs 中Bax 蛋白表達(dá)量降低（t=18.464，P=0.000），凋亡率降低（t=24.091，P=0.000），Bcl-2 蛋白表達(dá)量升高（t=20.409，P=0.000），細(xì)胞活力（48 h、72 h）升高（t48h=7.884，P=0.001；t72h=12.835，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3、圖1A、圖2A）。

表3 白楊素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs細(xì)胞增殖活力及凋亡的影響（，n=3）

表3 白楊素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs細(xì)胞增殖活力及凋亡的影響（，n=3）

注：a 與NG相比，P＜0.05；b 與HG相比，P＜0.05；c 與LCG相比，P＜0.05；d與MCG相比，P＜0.05。NG 正常組；HG 高糖組；LCG 白楊素低劑量組；MCG 白楊素中劑量組；HCG 白楊素高劑量組；Bcl B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白；Bax Bcl相關(guān)x蛋白

2.3 過(guò)表達(dá)GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs凋亡及氧化損傷的影響

與HG 組，pcDNA-GAS5 組HRMECs 細(xì)胞凋亡率降低（t=26.250，P=0.000），Bax蛋白表達(dá)量降低（t=1004.667，P=0.000），MDA含量降低（t=24.068，P=0.000），SOD 活性升高（t=29.198，P=0.000），Bcl-2 蛋白表達(dá)量升高（t=22.517，P=0.000），細(xì)胞活力（48 h、72 h）升高（t48h=7.754，P=0.001；t72h=13.612，P=0.000）；與pcDNA 組比較，pcDNA-GAS5 組HRMECs 細(xì)胞凋亡率降低（t=26.321，P=0.000），Bax蛋白表達(dá)量降低（t=1004.667，P=0.000），MDA含量降低（t=24.231，P=0.000），SOD 活性升高（t=29.259，P=0.000），Bcl-2 蛋白表達(dá)量升高（t=22.517，P=0.000），細(xì)胞活力（48 h、72 h）升高（t48h=7.323，P=0.002；t72h=13.244，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4、圖1B、圖2B）。

表4 GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs細(xì)胞增殖活力、凋亡及氧化損傷的影響（，n=3）

表4 GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs細(xì)胞增殖活力、凋亡及氧化損傷的影響（，n=3）

注：a 與HG相比，P＜0.05；b 與pcDNA相比，P＜0.05。HG 高糖組；pcDNA 空載質(zhì)粒；GAS5 生長(zhǎng)抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5；Bcl B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白；Bax Bcl相關(guān)x蛋白；MDA 丙二醛；SOD 超氧化物岐化酶

2.4 抑制GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs損傷的影響

與HG 組比較，HCG 組HRMECs 凋亡率降低（t=21.014，P=0.000），Bax 蛋白表達(dá)降低（t=22.743，P=0.000），MDA含量降低（t=29.448，P=0.000），Bcl-2蛋白表達(dá)升高（t=19.919，P=0.000），SOD 活性升高（t=23.893，P=0.000），細(xì)胞活力（48 h、72 h）升高（t48h=6.694，P=0.003；t72h=11.976，P=0.000）；與HCG+si-NC 組比較，HCG+si-GAS5 組HRMECs 凋亡率升高（t=14.135，P=0.000），Bax 蛋白表達(dá)升高（t=15.465，P=0.000），MDA含量升高（t=21.766，P=0.000），Bcl-2蛋白表達(dá)降低（t=13.280，P=0.000），SOD 活性降低（t=19.410，P=0.000），細(xì)胞活力（48 h、72 h）降低（t48h=4.909，P=0.008；t72h=9.581，P=0.001），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5、圖1C、圖2C）。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡圖。1A 白楊素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 凋亡的影響；1B GAS5 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 凋亡的影響；1C 抑制GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs凋亡的影響

圖2 western blot檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)圖。2A 白楊素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs中凋亡蛋白表達(dá)的影響；2B 白楊素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs中凋亡蛋白表達(dá)的影響；2C 抑制GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs中凋亡蛋白表達(dá)的影響

表5 抑制GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs細(xì)胞增殖活力、氧化損傷及凋亡的影響（，n=3）

表5 抑制GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs細(xì)胞增殖活力、氧化損傷及凋亡的影響（，n=3）

注：a 與HG相比，P＜0.05；b 與HCG+si-NC 相比，P＜0.05。HG 高糖組；si-NC 小干擾RNA陰性對(duì)照組；si-GAS5 小干擾RNA-生長(zhǎng)抑制特異性轉(zhuǎn)錄本5；Bcl B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白；Bax Bcl相關(guān)x蛋白；MDA 丙二醛；SOD 超氧化物岐化酶

3 討論

白楊素是菊科植物中黃酮類(lèi)化合物的主要活性成分，具有廣泛的藥理活性。研究顯示，白楊素可抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而對(duì)體內(nèi)、外炎癥反應(yīng)具有抑制作用[8]。白楊素還可抑制紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、活性氧產(chǎn)生以及環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2，COX-2）表達(dá)，保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免受紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的損傷[9]。本研究主要探討白楊素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 損傷的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖刺激后HRMECs 抗氧化酶SOD 活性顯著降低，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量、細(xì)胞凋亡率顯著增加，說(shuō)明DR細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。進(jìn)一步分析表明，中、高劑量的白楊素能增加SOD 活性，降低MDA 含量，抑制細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，說(shuō)明一定劑量的白楊素提高改善細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 損傷具有保護(hù)作用。與本研究發(fā)現(xiàn)類(lèi)似，Ali N 等[10]研究證實(shí)經(jīng)白楊素預(yù)處理后，可通過(guò)改善氧化應(yīng)激、組織病理改變和凋亡來(lái)預(yù)防甲氨蝶呤誘導(dǎo)的肝臟毒性。Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax表達(dá)增加、Bcl-2表達(dá)降低可誘導(dǎo)caspase-3活化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有研究指出白楊素能以劑量依賴(lài)性方式，恢復(fù)高糖暴露對(duì)腎足細(xì)胞中Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響[11]。本研究中高糖刺激能上調(diào)Bax 蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)，而白楊素預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)上述改變，進(jìn)一步證實(shí)白楊素的抗凋亡作用。以上數(shù)據(jù)提示白楊素對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs損傷具有保護(hù)作用。

lncRNA GAS5是非編碼RNA家族重要成員，其通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、化療耐藥，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡，在宮頸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中扮演抑癌基因角色[12-14]。此外，GAS5 被證實(shí)與多種細(xì)胞損傷相關(guān)。在膿毒癥誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷中GAS5表達(dá)降低，過(guò)表達(dá)GAS5 顯著減弱膿毒癥性足細(xì)胞損傷[15]。異硫維醇鈉通過(guò)調(diào)節(jié)GAS5 表達(dá)減弱調(diào)節(jié)缺血性卒中小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞極化，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16]。本研究中高糖刺激后HRMECs 中GAS5 表達(dá)量顯著降低，而中、高劑量的白楊素處理能逆轉(zhuǎn)上述改變，說(shuō)明白楊素的細(xì)胞保護(hù)作用可能與調(diào)控GAS5表達(dá)有關(guān)。驗(yàn)證GAS5功能顯示，過(guò)表達(dá)GAS5可增加SOD活性、Bax蛋白表達(dá)量，降低MDA 含量、Bcl-2蛋白表達(dá)量，抑制細(xì)胞凋亡，說(shuō)明過(guò)表達(dá)GAS5對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs 損傷具有保護(hù)作用。此外，干擾GAS5 表達(dá)能減弱白楊素處理對(duì)高糖誘導(dǎo)的HRMECs凋亡、氧化損傷的影響，這進(jìn)一步證實(shí)白楊素的保護(hù)作用可能與上調(diào)lncRNA GAS5表達(dá)有關(guān)。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，白楊素能夠減弱高糖誘導(dǎo)的HRMECs 凋亡、氧化損傷，其機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)lncRNA GAS5 表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。這闡明了白楊素的可能的保護(hù)作用機(jī)制，為白楊素用于防治DR 提供了一定理論支撐。