張漢琪， 戴偉鋒， 李寶才， 李進學(xué)， 張 敉，①

(1. 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 云南 昆明 650500； 2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟作物研究所， 云南 瑞麗 678600)

腐植酸(humic acid，HA)是植物殘體經(jīng)過微生物轉(zhuǎn)化以及一系列地球化學(xué)作用后形成的一類有機弱酸混合物[1-2]，根據(jù)相對分子質(zhì)量與溶解性大小，分為黃腐酸、棕腐酸和黑腐酸[3]。腐植酸具有改良土壤、增效肥料、刺激作物生長、增強作物抗逆性和改善作物品質(zhì)的作用[4]，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物種植等領(lǐng)域。

檸檬〔Citrus×limon(Linn.) Osbeck〕具有藥食兩用性[5]，其品質(zhì)鑒定指標(biāo)除了營養(yǎng)成分外，還包括功能成分[6]。檸檬果實和葉中豐富的揮發(fā)油和黃酮類成分是檸檬發(fā)揮藥用功能的主要活性物質(zhì)，也是檸檬加工品的主要原料[7-8]。作者所在課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，施用腐植酸葉面肥可提高檸檬葉中揮發(fā)油含量及抗氧化活性[9]。為進一步研究腐植酸類物質(zhì)對檸檬葉中黃酮類成分的影響及優(yōu)化施用濃度，本研究選擇不同質(zhì)量濃度黃腐酸和腐植酸鈉連續(xù)6個月澆灌檸檬改良品種‘云檸1號’(‘Yunning 1’)，對不同處理組葉中總黃酮含量進行比較和分析，評價腐植酸施用效果并得到較優(yōu)施用濃度，以期為腐植酸的科學(xué)應(yīng)用和檸檬的品質(zhì)提升提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為檸檬品種‘尤力克’(‘Eureka’)的改良品種‘云檸1號’，種植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟作物研究所檸檬基地(瑞麗站)，株齡3～4 a，株高0.9～1.5 m，種植于直徑50 cm、高50 cm的帆布花盆中，每盆1株，以瑞麗當(dāng)?shù)厮嵝酝翞榛|(zhì)，每盆裝4/5盆基質(zhì)。實驗在溫室大棚中進行。

參照文獻[10]中的方法，從褐煤(產(chǎn)自四川德陽)中提取黃腐酸和腐植酸鈉，黃腐酸中水分、灰分、總腐植酸、游離腐植酸和水溶性腐植酸的含量分別為4.05%、19.01%、20.11%、19.39%和19.05%，pH 3.88；腐植酸鈉中水分、灰分、總腐植酸、游離腐植酸和水溶性腐植酸的含量分別為2.61%、25.35%、59.72%、57.58%和58.68%，pH 7.62。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計與樣品采集 2020年10月開始，于每月1日對同一批‘云檸1號’幼樹連續(xù)6個月澆灌黃腐酸或腐植酸鈉溶液，澆灌質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5和1.0 g·L-1，每個質(zhì)量濃度設(shè)置6組重復(fù)，每組10株，每次每株澆灌4 L?？瞻捉M澆灌等體積自來水。每月15日或16日采集空白組和處理組植株四周新梢上2～3周新生葉，每組采集40～50 g，采集后立即用自封袋分裝并用干冰保存。

1.2.2 樣品處理 每組稱取新鮮檸檬葉30～35 g裝入紙袋中，于50 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱量后用200 mL體積分?jǐn)?shù)80%甲醇于25 ℃、25 kHz超聲提取45 min，抽濾，重復(fù)提取1次，合并2次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于43 ℃濃縮至適量體積，然后用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇定容至100 mL，即樣品溶液，于4 ℃保存、備用。

1.2.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制 準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(合肥博美生物公司，純度大于等于98%)，加入適量體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶解后定容至50 mL，于4 ℃保存、備用。

1.2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 準(zhǔn)確吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0和8.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色[11]，然后用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇定容至25 mL，于波長510 nm處測定吸光度(A510)。以A510值為縱坐標(biāo)(y)、蘆丁含量為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=11.037x+0.003，蘆丁含量的線性范圍為0.000～0.064 mg·mL-1，R2值為0.999 3。

1.2.5 總黃酮含量的測定 準(zhǔn)確吸取樣品溶液1.0 mL，按上述方法測定A510值，重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算總黃酮含量。

1.2.6 方法學(xué)考察

1.2.6.1 顯色穩(wěn)定性考察 隨機抽取3個樣品溶液，準(zhǔn)確吸取1.0 mL，采用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法，每隔15 min測定A510值，重復(fù)測定3次，結(jié)果取均值，連續(xù)測2 h。結(jié)果顯示：所有樣品的A510值均有所下降，但RSD值均小于2%，表明本方法的顯色穩(wěn)定性良好。

1.2.6.2 精密度考察 隨機抽取3個樣品溶液，采用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法，分別于同一天的7：00、13：00和19：00測定，每個樣品重復(fù)測定3次。另取1個樣品溶液，采用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法，于每日13：00測定A510值，每日重復(fù)測定3次，連續(xù)測定3 d。結(jié)果顯示：日內(nèi)與日間的A510值均有所下降，但RSD值均小于2%，表明本方法精密度良好。

1.2.6.3 加樣回收率測定 準(zhǔn)確吸取某一樣品溶液1.0 mL，測定總黃酮含量，再取同一樣品溶液1.0 mL，分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0、2.0和3.0 mL，后續(xù)操作同蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法，計算加樣回收率。結(jié)果顯示：樣品的平均加樣回收率為100.53%，RSD值為0.53%，表明本方法加樣回收率良好。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL 2019軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析和處理，采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件進行差異顯著性分析(LSD)。

2 結(jié)果和分析

連續(xù)澆灌不同質(zhì)量濃度黃腐酸和腐植酸鈉對檸檬品種‘云檸1號’葉中總黃酮含量的影響見表1。由表1可見：連續(xù)澆灌6個月，0.1和0.5 g·L-1黃腐酸處理組以及0.1、0.5和1.0 g·L-1腐植酸鈉處理組的總黃酮含量總體上高于空白組，其中，2021年2月的0.1和0.5 g·L-1黃腐酸處理組以及2020年10月和2021年2月的0.5和1.0 g·L-1腐植酸鈉處理組的總黃酮含量較空白組顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)升高。而2020年11月的1.0 g·L-1黃腐酸處理組和0.1 g·L-1腐植酸鈉處理組以及2020年12月的0.5和1.0 g·L-1黃腐酸處理組的總黃酮含量與空白組相比明顯下降。綜合比較結(jié)果顯示：處理前期，1.0 g·L-1腐植酸鈉處理組對檸檬品種‘云檸1號’葉中總黃酮含量的提升作用較好；處理后期，0.5 g·L-1黃腐酸處理組對檸檬品種‘云檸1號’葉中總黃酮含量的提升作用較好。

表1 連續(xù)澆灌不同質(zhì)量濃度黃腐酸和腐植酸鈉對檸檬品種‘云檸1號’葉中總黃酮含量的影響(n=6)1)

3 討論和結(jié)論

揮發(fā)油和黃酮類物質(zhì)是檸檬中頗具應(yīng)用價值的次生代謝產(chǎn)物。次生代謝產(chǎn)物是植物在長期進化過程中與環(huán)境相互作用的結(jié)果，但次生代謝產(chǎn)物在植物中含量很低，提高植物中次生代謝產(chǎn)物含量對該類成分的應(yīng)用具有現(xiàn)實意義。本研究通過比較連續(xù)6個月澆灌不同質(zhì)量濃度黃腐酸或腐植酸鈉后檸檬品種‘云檸1號’葉中總黃酮含量發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，澆灌黃腐酸和腐植酸鈉總體上對檸檬品種‘云檸1號’葉中總黃酮含量具有一定的提升作用，但不同月份及不同質(zhì)量濃度黃腐酸和腐植酸鈉處理組的作用水平存在差異，表現(xiàn)為1.0 g·L-1腐植酸鈉處理組在處理前期的提升作用較好，而0.5 g·L-1黃腐酸處理組處理后期的提升作用較好。