馬林玉，胡家銀，林 煊，陳鶴丹，謝穎，付文莉，楊君儀，劉麗娜

（貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院 生物與醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 貴州省免疫細(xì)胞與抗體工程研究中心 醫(yī)藥生物技術(shù)工程研究中心，貴陽 550025）

奶牛乳房炎（bovine mastitis）是造成乳品工業(yè)和奶牛生產(chǎn)巨大經(jīng)濟(jì)損失的重要疾病，發(fā)生的重要原因是病原細(xì)菌感染[1]。無乳鏈球菌（Streptococcus agalactia），是引起奶牛乳房炎最主要病原菌之一。獸醫(yī)臨床常采用抗生素進(jìn)行治療或/和預(yù)防奶牛乳房炎[2-3]?？股貧埩粢约伴L期使用以致耐藥菌株產(chǎn)生并在牛群中持續(xù)存在[4-5]，導(dǎo)致嚴(yán)重的食品安全問題。中草藥是天然物質(zhì)，具有低毒、無抗藥性、功能性強(qiáng)等特點(diǎn)，有效成分主要有多糖、生物堿、甙類等，中藥制劑具有促進(jìn)動(dòng)物生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率、抗菌、抗病毒、增強(qiáng)免疫力等功能[6]。中草藥替代抗生素是新的發(fā)展方向。近年來，從天然產(chǎn)物中尋找新的抗菌藥物成為廣大科學(xué)研究者的研究熱點(diǎn)[7]。為實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)、快速、高通量、大規(guī)模篩選無乳鏈球菌天然抗菌物質(zhì)，需先建立一種簡單、能準(zhǔn)確反映活細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的計(jì)數(shù)方法。MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長的方法，具有簡單、快速、靈敏度高等特點(diǎn)。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等[8]。本研究以平板菌落計(jì)數(shù)法作為參照方法，探討并優(yōu)化MTT法定量檢測(cè)無乳鏈球菌活細(xì)胞數(shù)有關(guān)的影響因素，獲得了最適反應(yīng)條件，建立了一種定量檢測(cè)無乳鏈球菌活菌數(shù)的MTT法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器奶牛乳房炎無乳鏈球菌臨床分離株由貴州醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)教研室培養(yǎng)和保存；THB培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）、十二烷基硫酸鈉（SDS）購自貴陽沃爾森生物技術(shù)有限公司；MultiskanTMGO全波長酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；723E紫外分光光度計(jì)購自天津冠澤科技有限公司；BioTek ELx 800全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自美國BioTek。

1.2 細(xì)菌的培養(yǎng)將甘油保存的無乳鏈球菌接種至THB固體平板上37℃過夜培養(yǎng)，次日，挑取生長良好的單菌落，接種到THB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16～18 h。按1%接種量轉(zhuǎn)接入新鮮THB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)至OD600值為0．5左右。

1.3 最大吸收波長測(cè)定選定初濃度OD600為0．5左右的無乳鏈球菌菌液，取100 μL于96孔板中，每樣3次平行，加入0．5 mg/mL MTT 30 μL，避光，37℃恒溫培養(yǎng)2 h。將含有MTT的菌液轉(zhuǎn)移至EP管，放入冷凍離心機(jī)，4℃、12 000×g離心10 min。棄上清液，每管加入100 μL DMSO，振蕩，搖勻，靜置10 min。向上述EP管中再加入促溶劑SDS 150 μL，混勻后轉(zhuǎn)移至96孔板中。以100 μL DMSO和150 μL SDS的混合液為對(duì)照。于全波長酶標(biāo)儀中，測(cè)定420～700 nm下的OD值。以測(cè)定波長為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)作圖，確定最大吸收波長。

1.4 MTT含量對(duì)吸收度的影響取1．2制備的菌液100 μL于96孔板中，每樣3次平行，分別加入0．5 mg/mL MTT溶液20、25、30、35、40、45、50、55、60 μL，混勻后避光置于37℃培養(yǎng)箱中，2 h后取出，將含有MTT的菌液轉(zhuǎn)移至EP管，放入冷凍離心機(jī)，于4℃、12 000×g離心10 min。棄上清液，每管加入100 μL DMSO，振蕩，搖勻，靜置10 min。向上述EP管中再加入150 μL SDS混勻，然后轉(zhuǎn)移至96孔板中。以100 μL DMSO和150 μL SDS的混合液為對(duì)照。在最大吸收波長下測(cè)定OD值，以不同含量MTT為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)作圖。

1.5 MTT反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸收度值的影響取1．2制備的菌液100 μL于96孔板中，每樣3個(gè)平行，加入1．4中最適量的MTT溶液，混勻后避光置于37℃培養(yǎng)箱中，分別于1、2、3、4、5、6 h后取出，將含有MTT的菌液轉(zhuǎn)移至EP管，放入冷凍離心機(jī)，于4℃、12 000×g離心10 min。棄上清液，每管加入100 μL DMSO，振蕩，搖勻，靜置10 min。向上述EP管中再加入150 μLSDS混勻，然后轉(zhuǎn)移至96孔板中。同樣以100 μL DMSO和150 μL SDS的混合液為對(duì)照。在1．3測(cè)定的最大吸收波長下測(cè)定OD值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)做圖。

1.6 DMSO用量對(duì)吸光度值的影響取1．2制備的菌液100 μL于96孔板中，每樣3次平行，加入1．4中最適量的MTT溶液，混勻后避光置于37℃培養(yǎng)箱中，按1．5最適反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)后取出，將含有MTT的菌液轉(zhuǎn)移至EP管，放入冷凍離心機(jī)，于4℃、12 000×g離心10 min。棄上清液，分別加入25、50、75、100、125、150 μL DMSO，振蕩，搖勻，靜置10 min。向上述EP管中再加入150 μL促溶劑SDS混勻，然后轉(zhuǎn)移至96孔板中。分別以25、50、75、100、125、150 μL DMSO和150 μL促溶劑SDS的混合液為對(duì)照。在1．3測(cè)定的最大吸收波長下測(cè)定OD值，以DMSO的不同用量為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)作圖。

1.7 MTT吸光度法與平板計(jì)數(shù)法的關(guān)系取1．2制備的菌液進(jìn)行倍比稀釋（即20～211）。以100 μL/孔加入96孔板中，每樣3次平行，以上述MTT法最適反應(yīng)條件測(cè)各孔吸光度值。同時(shí)將菌液以100 μL/皿均勻涂布于THB固體平板，37℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)各皿菌落數(shù)，以建立不同稀釋度菌液吸光度值與活菌數(shù)的關(guān)系曲線。

1.8 數(shù)據(jù)分析所有試驗(yàn)均重復(fù)≥3次，結(jié)果均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，數(shù)據(jù)用EXCEL軟件進(jìn)行處理并作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 最大吸收波長測(cè)定甲瓚在二甲基亞砜溶液中呈藍(lán)紫色，不同菌其最大吸收波長不同。因此，本研究于全波長酶標(biāo)儀中，測(cè)定420～700 nm下的OD值，以確定MTT法測(cè)定無乳鏈球菌活菌數(shù)的最大吸收波長。從圖1可見，最大吸收波長為570 nm。

圖1 最大吸收波長的檢測(cè)Fig.1 The detection of maximum absorption wave length

2.2 MTT含量對(duì)吸收度值的影響本實(shí)驗(yàn)選擇20～60 μL MTT用量，分別研究MTT量對(duì)吸光度值的影響。從圖2可見，隨著MTT用量的增加，吸光度值也不斷增加，MTT用量為45 μL時(shí)達(dá)到最大值，并趨于穩(wěn)定，而后隨著MTT量增加，吸光度值無變化。

圖2 不同體積MTT對(duì)吸光度值的影響Fig.2 The effect of volume of MTT to the absorbance value

2.3 MTT反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸收度值的影響菌體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶催化MTT生成甲瓚需要一定的時(shí)間才能完成，時(shí)間過短，反應(yīng)不完全，時(shí)間過長，反應(yīng)已完成反而多余時(shí)間被浪費(fèi)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇1～6h分別研究MTT反應(yīng)時(shí)間與吸光度值的關(guān)系。從圖3可見，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，吸光度值也不斷上升，反應(yīng)時(shí)間為3 h時(shí)吸光度值達(dá)到最大。

圖3 MTT作用時(shí)間對(duì)吸光度值的影響Fig.3 The effect of MTT reaction time to the absorbance value

2.4 DMSO用量對(duì)吸光度值的影響DMSO能溶解細(xì)胞中的MTT還原成的甲瓚，用酶標(biāo)儀在特定波長處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量[9]。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。從圖4可見，隨著DMSO用量的增加，OD570值也逐漸增加，DMSO加入量為125 μL時(shí)，OD570值達(dá)到峰值。

圖4 不同體積DMSO對(duì)吸光度值的影響Fig.4 The effect of volume of DMSO to the absorbance value

2.5 MTT吸光度法與平板計(jì)數(shù)法的關(guān)系用MTT法測(cè)得12個(gè)濃度梯度菌液（即20～211）OD570值，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)，結(jié)果見表1。將MTT法測(cè)得的吸光度值與相對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)建立線性關(guān)系曲線。如圖5所示，活菌數(shù)在1．5×107～4．73×108CFU/mL范圍內(nèi)與菌懸液的MTT吸光度值成線性相關(guān)，R2=0．9998，y=0．7915x-0．301，表明MTT法與平板菌落計(jì)數(shù)法定量結(jié)果具有較好的線性關(guān)系（R2＞0．99），MTT法可信度較高。

表1 不同菌體濃度所得OD570值Table 1 OD570 values of different concentration of bacterial suspension

圖5 MTT法與平板計(jì)數(shù)法的關(guān)系Fig.5 The relationship between the MTT method and plate colony counting method

無乳鏈球菌計(jì)數(shù)方法有平板菌落計(jì)數(shù)法和吸光度測(cè)定法[10]。平板菌落計(jì)數(shù)法重復(fù)性差、耗時(shí)長、而且不適合大批量實(shí)驗(yàn)；吸光度測(cè)定法不能反映活菌數(shù)。MTT法彌補(bǔ)了這兩種檢測(cè)方法的缺點(diǎn)，具有操作簡單、快速、重復(fù)性較好、能區(qū)分死活菌、適合于大規(guī)模藥物篩選等優(yōu)點(diǎn)[11-12]，已經(jīng)應(yīng)用于植物抗細(xì)胞增殖物質(zhì)成分篩選、病原微生物研究如木醋桿菌活力檢測(cè)、大腸桿菌活菌數(shù)測(cè)定，以及癌細(xì)胞增殖活性研究、細(xì)胞毒性研究等[13]。本研究建立了檢測(cè)無乳鏈球菌活菌數(shù)的MTT方法，定量檢測(cè)細(xì)菌濃度在1．5×107～4．73×108CFU/mL時(shí)，檢測(cè)結(jié)果與平板菌落計(jì)數(shù)具有較好的線性關(guān)系。