李 航，陳宗艷，劉光清，李傳峰

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）是多細(xì)胞動(dòng)物體內(nèi)的一種重要糖蛋白，也是血漿中主要結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)鐵的β球蛋白。目前，Tf家族主要包括血清轉(zhuǎn)鐵蛋白（serum transferrin，sTF）、乳鐵蛋白（Lactoferrin，LTF）和卵鐵蛋白（ovotransferrin，OVT）[1]。其中，LTF是人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的一種重要的可溶性非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白，分子量約為80 kDa。LTF廣泛分布于體液如乳汁、唾液、淚液等外分泌液和血漿及中性粒細(xì)胞中，其中以乳腺組織中的乳腺上皮細(xì)胞合成和分泌的最多[2-3]。

一方面，根據(jù)國家農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的194號(hào)公告，為了維護(hù)動(dòng)物源食品安全及保障公共衛(wèi)生，自2020年1月1日起，我國飼料中全面禁止添加抗生素，因此研制安全有效的抗生素替代性制品來保護(hù)人類和動(dòng)物的健康已然成為了首要的選擇。另一方面，盡管在犬、貓及某些特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的養(yǎng)殖中已有商品化的疫苗投放市場(chǎng)，但是病毒或細(xì)菌常存在變異或重組，致使犬、貓傳染病仍然沒有得到有效的控制。因此，需要開發(fā)新的生物制品提高犬、貓的自身免疫能力來增強(qiáng)抵抗致病微生物的侵襲[4]。作為轉(zhuǎn)鐵蛋白家族中的主要成員之一，LTF最初是在牛乳汁中被發(fā)現(xiàn)并分離得到，其主要的作用是為新生仔畜轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子并作為母畜乳腺及新生仔畜胃腸道的一種防御屏障[5]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，LTF是一種具有多種功能的鐵結(jié)合蛋白，在免疫調(diào)節(jié)和預(yù)防細(xì)菌、真菌和病毒疾病中具有重要作用[6-8]。

目前，國內(nèi)外對(duì)LTF蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能進(jìn)行了較為深入的研究，然而研究的對(duì)象主要集中在人、奶牛和小鼠等物種上，對(duì)于犬LTF的研究鮮有報(bào)道，嚴(yán)重制約了犬LTF的開發(fā)和利用。鑒于此，本研究采用RT-PCR技術(shù)對(duì)犬LTF基因CDS全長序列進(jìn)行克隆，并通過生物信息學(xué)方法對(duì)其編碼產(chǎn)物氨基酸理化特性、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、親水性、抗原表位、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為深入研究犬源LTF的分子結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為下一步LTF的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料犬乳腺組織是由上海市某寵物醫(yī)院提供；原核表達(dá)載體pGEX-4T-1由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌BL21（DE3）、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；各類酶制劑（EcoR Ⅰ、XhoⅠ、LATaqpremix）購自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小劑量提取試劑盒與DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank收錄的犬LTF基因mRNA序列（GenBank登錄號(hào)：NM_001287076）將目的基因分成A和B兩段（A片段與B片段覆蓋犬LTF基因編碼區(qū)）來設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物。A片段上游引物（AF）：5'-CTCTGGAGTCG CCTCAGGAG-3'，下游引物（AR）：5'-AACCT TCCGCCAGTCTATCC-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長度為1500 bp；B片段上游引物（BF）：5'-GCCAGTGGACG CATTCAA-3'，下游引物（BR）：5'-GGCCAGGCAGT CTTCTCATG-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長度為1300 bp。犬LTF蛋白基因構(gòu)建質(zhì)粒，通過同源重組需重新設(shè)計(jì)引物，上游引物（LTF-F）：5'-CGCGGATCCGCGA TGAAGCTAGTTTTTCCTGCCCT-3'（下劃線處為EcoR Ⅰ的酶切位點(diǎn)）；下游引物（LTF-R）：5'-CCGCTCGACCGGTGCGCCTTCCTGAGGAGATAA-3'（下劃線處為XhoⅠ的酶切位點(diǎn)）。引物合成由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1.3 犬LTF的mRNA的提取與目的基因的擴(kuò)增取成年母犬的乳腺組織為材料，采用RNA提取試劑盒提取犬乳腺組織中的總RNA并檢測(cè)濃度后進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄后，以提取cDNA（基因融合用A片段與B片段）作為模板，構(gòu)建擴(kuò)增體系（20 μL）：RNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，LATaqpremix 10 μL，加入無RNase-free H2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)條件：頂蓋溫度105℃，94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火2 min，72℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min，12℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，膠回收PCR產(chǎn)物。

1.4 LTF基因的克隆與鑒定將純化后的DNA與經(jīng)過EcoR Ⅰ、XhoⅠ雙酶切后的線性化載體用Infusion進(jìn)行同源重組，使片段與載體pGEX-4T-1連接，再將其轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃過夜培養(yǎng)。經(jīng)氨芐抗性與藍(lán)白斑篩選挑取8～12個(gè)陽性菌落于500 μL含氨芐的LB培養(yǎng)液中，置于37 ℃、220 rpm搖床中震蕩培養(yǎng)3～6 h，取2 μL菌液作為PCR體系中的模板進(jìn)行菌液PCR鑒定。將陽性菌液送測(cè)序，并將陽性重組質(zhì)粒命名為pGEX-4T-LTF。

1.5 犬LTF基因生物信息學(xué)分析根據(jù)測(cè)序得出的犬LTF基因序列，通過生物軟件與在線網(wǎng)站對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)，LTF遺傳進(jìn)化樹分析（DNAStar），編碼氨基酸理化特性分析（https://web．expasy．org/protparam/），編碼跨膜區(qū)分析（http://www．cbs．dtu．dk/services/TMHMM/），編碼蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)（http://www．cbs．dtu．dk/services/SignalP-2．0/），編碼蛋白親水性疏水性分析（http://us．expasy．org/cgi-bin/protscale．pl），編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（https://npsa-prabi．ibcp．fr/cgi-bin/npsa_automat．pl?page=/NPSA/npsa_hnn．html），編碼蛋白結(jié)構(gòu)域分析（http://smart．embl-heidelberg．de/smart/list_genomes．pl），亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)（https://www．genscript．com/psort．html），編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)建模及預(yù)測(cè)（https://swissmodel．expasy．org/interactive），B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)（http://tools．immuneepitope．org/main/bcell/），T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)（http://imed．med．ucm．es/Tools/rankpep．html）[9-13]。

2 結(jié)果

2.1 LTF基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果由A片段基因與B片段基因擴(kuò)增結(jié)果可知（圖1），目的基因融合后擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳分析可見一條約2100 bp的條帶（圖2），與GenBank中預(yù)測(cè)的犬乳鐵蛋白基因編碼區(qū)大小一致（2127 bp）。

圖1 犬LTF基因中A片段與B片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoretic map of PCR amplification products of A and B fragments in canine LTF gene

圖2 犬LTF基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.2 Electrophoretic map of PCR amplification products of canine LTF gene

2.2 LTF重組質(zhì)粒的鑒定與測(cè)序重組后的帶有目的基因的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定可見與目的基因大小一致的條帶。測(cè)序結(jié)果分析確定該基因片段為2127 bp。

2.3 LTF同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析使用DNAStar對(duì)犬與人等其他哺乳動(dòng)物（奶牛、馬、山羊、綿羊、豬、猴子、鼠）的LTF蛋白核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），進(jìn)行氨基酸同源性分析（圖4）。根據(jù)結(jié)果可知犬與貓LTF的遺傳距離最近，氨基酸同源性最高（83．0%）與馬、奶牛、山羊、綿羊等哺乳動(dòng)物L(fēng)TF的遺傳進(jìn)化距離稍遠(yuǎn)，氨基酸同源性達(dá)到70%以上，與小鼠的LTF氨基酸同源性最低，為67．6%。因此，LTF蛋白在哺乳動(dòng)物中具有較高的保守性。

圖3 LTF核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of LTF nucleotide sequences

圖4 犬LTF與其他哺乳動(dòng)物L(fēng)TF氨基酸同源性比對(duì)Fig.4 Comparison of amino acid homology between canine LTF and LTFs of other mammals

2.4 犬LTF編碼基因理化特性分析及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)犬LTF蛋白由708個(gè)氨基酸，其編碼基因中4種堿基比例如下：Ala占24．6%，Cys占24．8%，Ghy占28．8%，Thr占21．9%。分子式為C6234H10343N2127O2593S527，分子重量為77 kDa。脂肪族指數(shù)為24．59。預(yù)估半衰期分別為：4．4 h（哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞，體外）、20 h（酵母，體內(nèi)）、10 h（大腸桿菌，體內(nèi)）。不穩(wěn)定數(shù)為46．46（＞40），屬于不穩(wěn)定編碼基因。根據(jù)在線網(wǎng)站（https://www．genscript．com/psort．html）分析可知，犬LTF蛋白有45%在細(xì)胞外分布，41．9%在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)很少。

2.5 犬LTF基因編碼蛋白質(zhì)的親水性疏水性預(yù)測(cè)如圖5所示，犬LTF基因編碼蛋白氨基酸序列第7位（Ala丙氨酸）疏水性最強(qiáng)（2．80），第243位（Gln谷氨酰胺）親水性最強(qiáng)（-2．756）。犬LTF所有氨基酸中疏水性氨基酸占38．7%，親水性氨基酸占總數(shù)61．3%，疏水性均值為-0．278，該蛋白表現(xiàn)為親水性（其他哺乳動(dòng)物乳鐵蛋白多是表現(xiàn)為疏水性），因而可以推斷出犬LTF基因編碼的蛋白質(zhì)為可溶性蛋白。

圖5 犬LTF基因編碼蛋白疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 Prediction of hydrophobicity of protein encoded by canine LTF gene

2.6 犬LTF的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)及結(jié)構(gòu)域分析通過ExPASy對(duì)犬LTF蛋白分析，其蛋白分子質(zhì)量為77 kDa，等電點(diǎn)為8．62，正電荷氨基酸殘基總數(shù)為90個(gè)，而負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)為76個(gè)。使用https://npsa-prabi．ibcp．fr/cgi-bin/npsa_automat．pl?page=/NPSA/npsa_hnn．html線軟件對(duì)犬LTF蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)得出，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋（Hh）占36．44%，延長鏈（Ee）占15．11%，無規(guī)則卷曲（Cc）占48．45%，α-螺旋與β-折疊沿蛋白質(zhì)氨基酸順序交替排列，和其他哺乳動(dòng)物乳鐵蛋白大體相似。使用TMHMM對(duì)犬LTF蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)分析，可以得出犬LTF蛋白的708個(gè)氨基酸位于細(xì)胞膜表面（圖6），與其他哺乳動(dòng)物對(duì)比，只有犬LTF蛋白氨基酸全部位于細(xì)胞膜表面。使用http://www．cbs．dtu．dk/services/SignalP-2．0/在線網(wǎng)站進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果（圖7），可知信號(hào)肽序列為MKLVFPLLFLGALGLCLA，犬LTF的第19～20位間有信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)。犬LTF蛋白在大腸桿菌DH5α細(xì)胞中無法高效表達(dá)可能與其自身攜帶的信號(hào)肽有一定的影響。使用http://smart．embl-heidelberg．de/smart/list genomes．pl在線網(wǎng)站進(jìn)行犬LTF蛋白與其他同源哺乳蛋白進(jìn)行分析，得知TF家族成員是由兩個(gè)同源結(jié)構(gòu)域的復(fù)制和融合產(chǎn)生的，該類轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)構(gòu)域可以進(jìn)一步分化為兩個(gè)亞域，形成一個(gè)裂隙，在裂隙中鐵原子和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合在一起。

圖6 犬LTF蛋白的跨膜區(qū)分析Fig.6 Analysis of transmembrane region of canine LTF protein

圖7 犬LTF基因蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of signal peptide of canine LTF gene protein

2.7 犬LTF蛋白B細(xì)胞抗原表位和T細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)通過Kyte-Doolittle法分析犬LTF蛋白親水性，綜合其親水性、α-螺旋和β-折疊區(qū)域、表面可及性和抗原指數(shù)性區(qū)域（圖8）等分析結(jié)果，預(yù)測(cè)犬LTF蛋白可能存在抗原表位的5條B細(xì)胞抗原表位肽，分別為TGPPEPLE158-165、EKDSDSAE352-359、QKSQNPSD434-441、EKGENKCAPNN528-538、T N G G N P E P W A 5 7 1-5 8 0。通過在線網(wǎng)站（http://imed．med．ucm．es/Tools/rankpep．html）進(jìn)行犬LTF蛋白Th表位預(yù)測(cè)，MHC-Ⅱ類分子選擇HLA-DR1（DBR1*0101）、HLA-DR17（DBR1*0301）、HLA-DR4（DBR1*0401）、HLA-DR7（DBR1*0701）四個(gè)類型綜合選取15個(gè)氨基酸組成的得分最高的作為候選Th表位肽（FDEFFSQSCAPGADP505-519）。

圖8 犬LTF蛋白B細(xì)胞抗原表位Fig.8 B cell epitopes of canine LTF protein

2.8 犬LTF蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)目前常用的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)有同源性建模、串聯(lián)算法和折疊的識(shí)別，但是串聯(lián)算法與折疊識(shí)別的準(zhǔn)確率并不高，本文采用同源性建模的方式來預(yù)測(cè)犬LTF蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，通過SWISS-MODEL在線分析犬LTF蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖9），用該蛋白同家族其他蛋白（駱駝乳鐵蛋白，GenBank登錄號(hào)：CAB53387．1）作為模板，發(fā)現(xiàn)駱駝乳鐵蛋白與犬LTF蛋白序列一致度達(dá)到74．82%（圖10），且GMQE值達(dá)0．84（可信范圍為0～1，數(shù)值越大表明質(zhì)量越好），QMEAN值為-1．92（區(qū)間為-4～0，數(shù)值越接近0，評(píng)估待測(cè)蛋白與模板蛋白的匹配越好）結(jié)構(gòu)顯示三級(jí)結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲較多，α-螺旋較為集中，與二級(jí)結(jié)構(gòu)大致相符，在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上折疊成兩個(gè)基本相等的葉，兩葉再進(jìn)一步分化成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，這一點(diǎn)與駱駝乳鐵蛋白的結(jié)構(gòu)基本相似。

圖9 犬LTF蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.9 Prediction of tertiary structure of canine LTF protein

圖10 犬LTF蛋白氨基酸序列與駱駝LTF蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig.10 Alignment of canine LTF protein amino acid sequence with camel LTF protein amino acid sequence

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，LTF不僅是一種重要的生理活性物質(zhì)，能夠促進(jìn)對(duì)鐵的吸收、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗癌及促進(jìn)細(xì)胞分化和增殖等，而且具有抵御細(xì)菌、病毒、酵母、寄生蟲和真菌等病原微生物的生物活性[14-15]。因此，可以利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)將犬源LTF開發(fā)成寵物及特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物食品或日糧添加劑來預(yù)防和控制動(dòng)物疾病的發(fā)生。

本研究通過對(duì)犬LTF蛋白基因的克隆，得到了犬LTF基因CDS全長，但由于基因片段較長，最初通過設(shè)計(jì)引物的方式未成功擴(kuò)增出其全長，而后通過基因融合方式將其劃分為兩條基因片段拼接擴(kuò)增出其全長基因[16]。在后續(xù)Western blot實(shí)驗(yàn)中確定了LTF蛋白的表達(dá)（文章中未展示），可知該蛋白在上清液中并不表達(dá)，所以通過GST標(biāo)簽純化試劑盒進(jìn)行沉淀蛋白純化，但表達(dá)量始終較低，這可能與LTF所具備廣譜抗菌和抑菌作用抑制了大腸桿菌DH5α的生長有一定關(guān)系；根據(jù)對(duì)犬LTF的信號(hào)肽預(yù)測(cè)，顯示犬LTF的第1-19位含有信號(hào)肽序列MKLVFPLLFLGALGLCLA，可能影響了其在大腸桿菌DH5α中的表達(dá)。因此下一步采取的措施是在其19-20位信號(hào)肽剪切位點(diǎn)去掉信號(hào)肽，重新設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建新的原核表達(dá)載體并提高蛋白表達(dá)量從而大量純化出犬LTF蛋白。

通過一系列的生物信息學(xué)分析，如和不同動(dòng)物的基因序列比對(duì)可得出，其與貓LTF基因同源性最好，且LTF耐受高溫，在飼料加工中也不 易失活,為后續(xù)通過大量純化犬乳鐵蛋白加入犬、貓或特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物日糧添加劑提供了一定的數(shù)據(jù)支持。對(duì)犬LTF基因理化性分析可知該基因半衰期較短，穩(wěn)定性不高；對(duì)其一級(jí)與二級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域的分析預(yù)測(cè)結(jié)果表明，犬LTF蛋白是一個(gè)可溶性蛋白，親水性較強(qiáng)，疏水性較弱，而大多數(shù)哺乳動(dòng)物乳鐵蛋白N端與C端都具有高疏水性，但是該家族蛋白結(jié)構(gòu)域大體相似；亞細(xì)胞定位犬LTF有45%在細(xì)胞外分布，41．9%在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)很少，最大可能性為定位于細(xì)胞膜外，說明犬LTF蛋白既可在胞外，也可在胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮功能；蛋白結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和不規(guī)則彎曲組成，β-折疊散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中；而B細(xì)胞抗原表位與T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)對(duì)疾病的診斷及預(yù)后判定、定點(diǎn)改造蛋白質(zhì)分子以降低蛋白子藥物的免疫原性等有著重要的作用；通過SWISS-MODEL的比對(duì)可知犬 乳鐵蛋白氨基酸序列與駱駝乳鐵蛋白氨基酸序列一致性高達(dá)74．82%，是非常優(yōu)等的一個(gè)結(jié)構(gòu)模型，這也揭示了犬乳鐵蛋白可能與駱駝乳鐵蛋白功能具有相關(guān)性，或者與其在pH值較高時(shí)c-葉像轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白一樣失鐵，或者是與駱駝乳鐵蛋白一樣同時(shí)具有鐵結(jié)合、釋放乳鐵蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)乳鐵蛋白功能的蛋白，這些推測(cè)均需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。本研究通過克隆獲得了犬LTF基因，并對(duì)該基因進(jìn)行了詳盡的生物信息學(xué)分析，為下一步構(gòu)建犬LTF原核和真核表達(dá)載體，進(jìn)一步探究其分子機(jī)制及抗菌、抗病毒、抗腫瘤與增強(qiáng)免疫力等功能奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。