劉美妍 周國彥 李曉麗 銀珊珊 邢雨蒙 謝洋

摘? ? 要：為探討適宜華北型密刺黃瓜多倍體誘導(dǎo)技術(shù)體系，以黃瓜（2n=2x=14）種子期、萌動種子期和子葉期為試材進(jìn)行不同濃度秋水仙素處理，通過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)鑒定，成功獲得三倍體（3x）、四倍體（4x）和混倍體（2x+4x/8x+16x）植株，并對二倍體和四倍體黃瓜進(jìn)行農(nóng)藝性狀和營養(yǎng)品質(zhì)分析。結(jié)果表明，0.4%秋水仙素處理黃瓜萌動種子4 h誘導(dǎo)四倍體的效果最佳，DNA誘變率為18%;0.2%秋水仙素處理黃瓜種子2 h誘導(dǎo)三倍體和混倍體效果最佳，DNA誘變率為15%;四倍體較二倍體節(jié)間變短，葉色油亮，葉面積、雌花器官增大，花粉粒呈四孔，染色體、DNA含量加倍，果形指數(shù)減小幅度達(dá)35.66%，可溶性糖含量和硬度增幅分別為91.74%和34.73%。研究結(jié)果為黃瓜多倍體種質(zhì)創(chuàng)制奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：黃瓜;秋水仙素;多倍體;流式細(xì)胞術(shù);果實品質(zhì)

中圖分類號：S635.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）11-010-07

Mutagenesis effect of colchicine on north China cucumber with dense thorny

LIU Meiyan1， ZHOU Guoyan1， LI Xiaoli1，2， YIN Shanshan1， XING Yumeng1， XIE Yang1，2

（1. College of Horticulture Science and Technology， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066004， Hebei， China; 2. Hebei Key Laboratory of Horticultural Germplasm Excavation and Innovative Utilization， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066004， Hebei， China）

Abstract： In order to explore the technology suitable for the induction of autotetraploid of north China cucumber with dense thorny， the cucumber （2n=2x=14） was treated with colchicine at different concentrations at seed stage， germination stage and cotyledon stage. The triploid （3x）， tetraploid （4x） and miploid （2x +4x/ 8x+16x） plants were successfully obtained by morphological， cytological and flow cytometry. The agronomic traits and nutritional quality of diploid and autotetraploid cucumbers were identified. The results showed that 0.4% colchicine treatment for 4h had the best effect on inducing autetraploid， and the induction rate was 18%， 0.2% colchicine treatment for 2 h had the best effect on inducing triploid and misoploid seeds， and the induction rate was 15%. Compared with diploid， autotetraploid showed shorter internode， grey-green leaf color， increased leaf area， female flower organs and stomata， four-hole pollen grains， double chromosome and DNA content， fruit shape index decreased by 35.66%， soluble sugar content and hardness increased by 91.74% and 34.73%， respectively. This study laid a technical foundation for the creation of cucumber polyploid germplasm.

Key words： Cucumber; Colchicine; Polyploid; Flow cytometry; Fruit quality

黃瓜（Cucumis sativus L.，CC，2n=2x=14），又名青瓜、胡瓜，屬于葫蘆科黃瓜屬，是世界十大蔬菜之一[1]。黃瓜營養(yǎng)豐富，含維生素C、蛋白質(zhì)、糖類和人體必需的有益礦物質(zhì)，具食療價值，深受人們喜愛，在我國設(shè)施蔬菜生產(chǎn)和周年供應(yīng)中占有重要地位[2]。因黃瓜栽培種的遺傳基礎(chǔ)狹窄，不僅限制了其產(chǎn)量和品質(zhì)的進(jìn)一步改良，而且使黃瓜對逆境環(huán)境的適應(yīng)能力減弱[3-4]。

多倍體是大多數(shù)陸地植物譜系中存在超過2套完整染色體組的生物體，是促進(jìn)生物進(jìn)化和遺傳多樣性的重要力量[5]。多倍體植物因其具有較強(qiáng)可塑性，即染色體多倍化后拓寬了物種的遺傳變異范圍及增強(qiáng)了對外界脅迫的緩沖能力，有利于創(chuàng)建優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的新品種和增強(qiáng)植物的抗病、抗逆能力[6]。迄今為止，多倍體育種已廣泛應(yīng)用在西瓜、甜瓜、黃瓜、番茄、馬鈴薯、白菜、蘿卜等蔬菜作物的育種工作中。例如，利用多倍體的巨大性培育出的同源四倍體蘿卜小頂紅，與其二倍體相比，氣孔、花粉粒、花器官、葉片和肉質(zhì)根等都增大，同時表現(xiàn)出高可溶性糖、可溶性蛋白和維生素C等優(yōu)良品質(zhì)[7];利用多倍體低育性培育出優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)無籽西瓜津蜜55、雪峰新二號等新品種[8-9];利用多倍體抗病、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，培育出抗病毒病、軟腐病、霜霉病和抗逆性強(qiáng)四倍體白菜品種多維462[10];利用染色體多倍化可以克服遠(yuǎn)緣雜交障礙培育新品種。

蔬菜多倍體種質(zhì)創(chuàng)制是培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)蔬菜新品種的一個重要途徑，為蔬菜品質(zhì)性狀遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新提供了一個新思路[11]。目前黃瓜多倍體材料陸續(xù)被創(chuàng)制出來，如利用秋水仙素誘導(dǎo)子葉期幼苗、萌動種子或干種子分別獲得歐洲溫室型、華北型無毛黃瓜同源四倍體等[12-15]。但關(guān)于不同誘導(dǎo)技術(shù)體系的誘導(dǎo)效應(yīng)的比較研究鮮有報道。鑒于此，筆者以津研四號黃瓜為試材，采用不同濃度秋水仙素對干種子、萌動種子和子葉期幼苗進(jìn)行誘導(dǎo)處理，通過形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)鑒定，探究不同誘導(dǎo)體系的多倍化效應(yīng)，并對二、四倍體黃瓜進(jìn)行農(nóng)藝性狀和營養(yǎng)品質(zhì)鑒定。以期篩選最優(yōu)的多倍體誘導(dǎo)與鑒定體系，為豐富黃瓜種質(zhì)資源提供技術(shù)理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2019年8—12月在河北科技師范學(xué)院園藝中心實驗室和園藝園林試驗站1號日光溫室中進(jìn)行。供試材料為津研四號黃瓜（2n=2x=14），購于山東魯蔬種業(yè)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)劑配制 0.2%、0.3%和0.4%秋水仙素溶液配制：分別稱取0.2、0.3、0.4 g秋水仙素粉末于小燒杯中，加入100 μL 95%酒精助溶，再加50 mL蒸餾水溶解后倒入100 mL容量瓶中定容。完成后裝入棕色瓶，整個配制過程避光，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多倍體誘導(dǎo) 子葉期誘導(dǎo)、種子期誘導(dǎo)和萌動種子期誘導(dǎo)的樣本量均為50粒種子，以蒸餾水處理為對照。子葉生長點(diǎn)誘導(dǎo)（T1）：經(jīng)溫湯浸種與催芽后的種子播種于50孔穴盤內(nèi)，于日光溫室中育苗。待子葉展平后，將棉球置于生長點(diǎn)，用膠頭滴管吸取0.3%秋水仙素溶液，滴于棉球上，完全浸濕棉球。每日9：00和17：00處理，共計6次。萌動種子誘導(dǎo)（T2）：50粒種子溫湯浸種后種子放置28 ℃恒溫箱中催芽，待胚根長度至0.3～0.5 cm，用0.4%秋水仙素處理，蒸餾水作對照，于搖床（震蕩速度為50 r·min-1）上避光處理2 h，處理后用清水沖洗3次，播于50孔穴盤。吸脹種子誘導(dǎo)（T3）：種子浸種2 h后，放入50 mL移液管中，加入3.5 mL的0.2%秋水仙素溶液，避光處理2 h，處理完畢用清水沖洗3次，播于50孔穴盤。相關(guān)指標(biāo)測定公式為：致死率/%=死亡的株數(shù)/總株數(shù)×100，誘變率/%=產(chǎn)生變異的株數(shù)/總株數(shù)×100。

1.2.3 流式細(xì)胞儀鑒定 取對照株（2x）與誘變株黃瓜葉片0.2 g置于熒光染料DAPI緩沖液內(nèi)，用手術(shù)刀切碎，懸浮液經(jīng)20 μmol·L-1尼龍網(wǎng)過濾，調(diào)整細(xì)胞核密度至 10萬～30萬個·mL-1。用流式細(xì)胞儀檢測每個細(xì)胞和熒光信號強(qiáng)度，并經(jīng)儀器自動分析。選擇通道，上機(jī)5000個顆粒，進(jìn)行分析[16]。

1.2.4 形態(tài)學(xué)觀察 于苗期和結(jié)果期分別觀察對照與誘變株的形態(tài)特征，調(diào)查苗期子葉、節(jié)間、分枝性、葉色、葉形、花器官、果實外觀品質(zhì)性狀等指標(biāo)，其測定方法參考黃瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范[17]。

1.2.5 細(xì)胞學(xué)觀察 花粉粒觀察：于晴天9：00—10：00選取長勢旺盛的對照與誘變株（當(dāng)代）的開放花朵，在載玻片中央滴1滴清水，用手撥動花朵，將花粉散落于清水中，輕蓋蓋玻片，置于顯微鏡下觀察[18-19]。染色體觀察：于8：00取未開放雄花，用鑷子取出花藥，散落放入載玻片上，滴加品紅染色液，烤片再壓片，置于顯微鏡下觀察[20]。

1.2.6 果實營養(yǎng)品質(zhì)測定 采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[21]，采用蒽酮比色法測定可溶性糖含量[22]，采用2-6二氯酚靛酚滴定法測定維生素C含量[23]，采用數(shù)字折光儀測定可溶性固形物含量，采用果實硬度顯示計測定果實硬度。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 利用Microsoft Excel 2010和DPS 9.01軟件進(jìn)行黃瓜形態(tài)指標(biāo)、誘變指標(biāo)、果實營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)等相關(guān)數(shù)據(jù)的錄入及統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對黃瓜多倍體誘導(dǎo)的效果

對比黃瓜多倍體誘導(dǎo)的3種秋水仙素處理方法發(fā)現(xiàn)，形態(tài)變異率均在40%以上，0.4%秋水仙素處理萌動種子4 h（T2）的DNA誘變率最高，高達(dá)18%，但同時致死率也最高，為28%。0.3%秋水仙素處理子葉期黃瓜生長點(diǎn)6次（T1）的誘導(dǎo)效果，其致死率最低，為22%，但DNA誘變率也最低，為9%。0.2%秋水仙素處理種子2 h（T3）的致死率和DNA誘變率均居中，分別為24%和15%（表1）。

通過對二倍體對照和誘變株的苗期（日歷苗齡相同）觀察，發(fā)現(xiàn)3種秋水仙素誘導(dǎo)方式下，幼苗的生長速度明顯不同，速度從大到小依次為子葉期T1、種子期T3和萌動種子期T2處理;葉形、葉色均發(fā)生改變，主要表現(xiàn)在誘變株葉面積增大、葉色變深、葉片加厚、葉緣呈鋸齒狀等方面（圖1）。

為了準(zhǔn)確鑒定出誘變株的倍性，分別提取對照和誘變株的基因組DNA，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行植株的倍性分析與鑒定。研究發(fā)現(xiàn)，誘變株中存在未發(fā)生加倍的二倍體（2x）和發(fā)生倍性變異的三倍體（3x）、四倍體（4x）、二倍體和四倍體混倍體（2x +4x）、八倍體和十六倍體混倍體（8x+16x）等（圖2）。由表1可知，子葉生長點(diǎn)處理的DNA誘變率為9%，萌動種子處理的DNA誘變率為18%;吸脹種子處理的DNA誘變率為15%，誘導(dǎo)三倍體（3x）、四倍體（4x）、混倍體（2x +4x）、混倍體（8x +16x）概率分別為3.5%、2.5%、2.8%和6.2%（流式細(xì)胞術(shù)測定數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果）。

2.2 黃瓜二倍體與四倍體形態(tài)學(xué)比較

對秋水仙素處理前后植株的營養(yǎng)器官進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察和測量，發(fā)現(xiàn)四倍體植株較二倍體植株（相同日歷苗齡）較矮壯，主莖較粗，差異顯著。其中莖橫徑增幅達(dá)29.79%，節(jié)間變短，降幅達(dá)12.95%;葉面積大，葉色油亮，葉綠素含量高且增幅達(dá)34.07%（表2，圖3）。

四倍體黃瓜與二倍體相比，雌花花瓣長、花瓣寬、子房寬均顯著增大，增幅分別為30.63%、42.24%、25.00%，花冠褶皺程度高;但雄花花瓣長、花瓣寬分別顯著減小29.91%、6.42%，雌花子房長極顯著減小33.91%（圖4，表3）。

四倍體黃瓜與二倍體相比，單瓜質(zhì)量顯著增大，瓜長顯著減小6.23%，瓜橫徑極顯著增大51.96%，果形指數(shù)極顯著減小，瓜把長顯著減小20.70%，瓜把橫徑顯著增大8.37%（圖4，表4）。

2.3 黃瓜二倍體與四倍體細(xì)胞學(xué)鑒定

利用花粉母細(xì)胞制片觀察發(fā)現(xiàn)，四倍體（4x）花粉粒存在畸形現(xiàn)象且有4個萌發(fā)孔，而二倍體黃瓜花粉粒大小一致性高，有3個萌發(fā)孔（圖5-a）。四倍體（4x）較二倍體（2x）染色體個數(shù)加倍，由原來的14條染色體加倍為28條染色體（圖5-b）。

2.4 黃瓜二倍體與四倍體果實營養(yǎng)品質(zhì)比較

四倍體較二倍體黃瓜的維生素C含量、可溶性固形物含量、果實硬度均顯著增高，可溶性糖含量極顯著增高，其中可溶性糖含量、硬度、維生素C含量增幅分別達(dá)91.74%、34.73%和11.10%（表5）。四倍體黃瓜可溶性蛋白含量較二倍體顯著下降26.16%（表5）。

3 討論與結(jié)論

多倍體誘導(dǎo)是創(chuàng)制新種質(zhì)的重要途徑之一[20]。目前人工誘導(dǎo)植物多倍體的方法有生物誘導(dǎo)、物理誘導(dǎo)和化學(xué)誘導(dǎo)，其中化學(xué)誘導(dǎo)主要是利用化學(xué)試劑如秋水仙素、植物激素及其他植物堿等人工誘導(dǎo)多倍體。化學(xué)誘導(dǎo)又分為體外誘導(dǎo)和體內(nèi)誘導(dǎo)，體內(nèi)誘導(dǎo)植物多倍體一般處理植物細(xì)胞分裂較旺盛的部位，常用方法包括浸種、涂抹生長點(diǎn)、浸芽等[24]。陳勁楓等[12]利用0.4%秋水仙素處理華北型黃瓜干種子和萌動種子4 h，獲得黃瓜四倍體植株，加倍率26.7%;武婭歌等[13]利用0.3%秋水仙素處理歐洲溫室型黃瓜子葉期生長點(diǎn)5次，獲得黃瓜四倍體植株和非整倍體植株，誘導(dǎo)率4%;劉永月等[14]利用0.4%秋水仙素和2%二甲基亞砜混合溶液處理萌動種子4 h，獲得無毛黃瓜四倍體，誘導(dǎo)率14%;鄢郁霖等[15]利用0.8%秋水仙素處理干種子和萌動種子4 h，獲得了露地型黃瓜四倍體，誘導(dǎo)率分別為1.81%和7.27%。筆者以津研四號為試材，綜合前人最佳的多倍體優(yōu)化體系，以種子期、萌動種子期和子葉期材料進(jìn)行不同濃度秋水仙素處理，通過形態(tài)學(xué)與DNA含量鑒定，成功獲得了四倍體材料。通過比較3種誘導(dǎo)體系發(fā)現(xiàn)，0.4%秋水仙素處理萌動種子4 h誘導(dǎo)四倍體的效果最佳（誘導(dǎo)率18%），0.2%秋水仙素處理種子2 h誘導(dǎo)三倍體和混倍體效果最佳（誘導(dǎo)率15%），而0.3%秋水仙素處理子葉期生長點(diǎn)6次（誘導(dǎo)率9%）效果低于前2種方式。以上結(jié)果與前人研究基本一致，0.4%秋水仙素處理萌動種子4 h可作為黃瓜四倍體誘導(dǎo)的最優(yōu)技術(shù)體系[12-15]。

基因劑量效應(yīng)使多倍體細(xì)胞體積、植物器官增大，細(xì)胞內(nèi)含物增多，往往表現(xiàn)出巨大性、高抗性，因而多倍體被認(rèn)為是植物進(jìn)化的加速器[25-26]。筆者誘導(dǎo)的四倍體植株在形態(tài)學(xué)特征上與二倍體相比差異明顯，四倍體較二倍體植株生長遲緩，但莖橫徑、葉寬、葉面積、雌花和果形指數(shù)均增大，節(jié)間長度、雄花、果實長度均減小。四倍體與二倍體細(xì)胞學(xué)特征比較發(fā)現(xiàn)，四倍體花粉粒較二倍體的體積增大，可能原因是四倍體有4個萌發(fā)孔，而二倍體僅有3個萌發(fā)孔。與前人報道相比，除雄花減小外，其他各指標(biāo)變化趨勢相一致[12-15]。

在果實外觀品質(zhì)方面，四倍體較二倍體最顯著的特征是果實變短變粗即果形指數(shù)減小，瓜把縮短且果實硬度變大;在果實營養(yǎng)品質(zhì)方面，四倍體較二倍體可溶性糖含量、維生素C含量、可溶性固形物含量顯著增加。關(guān)于黃瓜多倍體營養(yǎng)品質(zhì)方面的報道很少，但是與其他蔬菜如蘿卜、白菜、甜瓜等多倍體相比較是相一致的，黃瓜多倍體的營養(yǎng)品質(zhì)變化也是向更有利于物種進(jìn)化的方向變異[27-28]。本研究為黃瓜多倍體育種提供了技術(shù)支持，為雙子葉植物多倍體育種提供了參考。

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