胡兆勇 譚 勁 陳 明 楊慶澤 劉艷麗

1.湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院解剖實驗中心，湖南長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院口腔科，湖南長沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院，湖南長沙 410208

微RNA（microRNA，miRNA）是真核生物中廣泛存在的一種長為21～25 個核苷酸的非編碼RNA 分子。miRNA 可以通過特異性地結(jié)合到mRNA 的3’非翻譯區(qū)，抑制mRNA 的翻譯或直接斷裂靶標mRNA。目前已被發(fā)現(xiàn)的人類miRNA 超過1400 種，其中miR-21 在肺癌、乳腺癌、口腔癌等的組織中高表達[1-3]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤、細胞纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，miR-21 在口腔黏膜下纖維化組織中高表達[4]，但與口腔黏膜下纖維化癌變機制的關(guān)系尚不清楚?；诖?，本研究構(gòu)建口腔黏膜纖維化癌變細胞模型，初步探討miR-21-5p 的表達情況，并通過生物信息學分析預測miR-21-5p 的靶基因及進行GO、KEGG分析，旨在為進一步研究miR-21-5p 與口腔黏膜下纖維化癌變的作用機制奠定理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠原代口腔黏膜上皮細胞由上海賽百慷生物科技有限公司提供，貨號為RAT-iCell-m013，檳榔提取物由深圳潤慧生物科技有限公司提供。熒光定量PCR 儀由美國Thermo Quant 公司提供，型號為Studio1，臺式冷凍離心機由中國湖南湘儀公司提供，型號為H1650R；電泳儀由中國北京六一公司提供，型號為DYY-2C。

1.2 研究方法

1.2.1 培養(yǎng)細胞 將原代大鼠口腔黏膜上皮細胞按常規(guī)方式培養(yǎng)，選取對數(shù)期生長的細胞，將細胞懸液濃度調(diào)整為105個/ml，接種于12 孔板中，每孔接種400 μl，將12 孔板放在細胞培養(yǎng)箱中靜置24 h，待細胞貼壁并達到一定融匯度后，棄掉上清液，磷酸鹽緩沖液清洗，分為正常對照組和實驗組，每組3 個孔實驗組加入50 μg/ml 檳榔提取物誘導，構(gòu)建口腔黏膜下纖維化癌變細胞模型。

1.2.2 RT-qPCR 檢測miR-21 的表達 在網(wǎng)站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/24720 上搜索目的基因，采用Primer5 軟件設計引物，由上海生物公司合成引物。引物設計：目的基因序列在下面鏈接上搜索，Primer5 軟件設計引物，上海生物公司合成引物。正向引物：5’-GCCTACAGCCATACCACCCGGAA-3’。反向引物；5’-CCTACAGCACCCGGTATCCCA-3’。產(chǎn)物長度116 bp。rno-miR-21-5p：5’-CGCCGTTCCTAGCTTATCAGAC-3’。PCR 管中分別加入如下試劑：cDNA 模板2 μl，2×SYBGREEN PCR Master Mix 15 μl，正向引物（10 μmol/L）1 μl，反向引物（10 μmol/L）1 μl，ddH2O 11 μl，共30 μl。用移液槍吸打混勻后，將其分裝至3 個新的PCR管中（即每樣本檢測做3 個復孔），置于RT-qPCR 儀中進行PCR 反應。PCR 反應程序為：95℃10 min；95℃10 s，60℃30 s，重復40 個循環(huán)。所得結(jié)果采用2-ΔΔCt 法進行計算分析。

1.2.3 miR-21-5p 生物信息學分析 在靶標預測合集網(wǎng)站（http://ophid.utoronto.ca/mirDIP），利用miRDB、TargetScan 等30 個數(shù)據(jù)庫預測miR-21 的靶基因，為減少假陽性率，選取分數(shù)是所有預測基因中TOP1%并存在于至少9 個以上數(shù)據(jù)庫的靶基因。將預測的hsa-miR-21-5p 靶基因集合集進行GO 和KEGG 分析。GO 功能富集分析結(jié)果以氣泡圖展現(xiàn)，橫軸代表基因比，縱軸為富集術(shù)語，原點的顏色從綠至紅代表校正P 值越來越小，原點的大小代表相關(guān)基因的數(shù)量。GO 分析包括生物過程、細胞組成、分子功能，利用g-profiler 軟件進行GO 注釋分析。KEGG 通路分析時利用Fisher Exact Test 計算P 值，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-21-5P 表達情況比較

實驗組miR-21-5p 的表達明顯高于正常對照組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）。見表1。

表1 兩組miR-21-5p 表達情況

2.2 miR-21-5p 的靶基因預測結(jié)果

預測得到miRNA-21 的靶基因共994 個，其中綜合得分排前三的是Smad7、PLAG1、TGF-β1。見表2。

表2 miR-21-5p 靶基因預測（僅展示部分結(jié)果）

2.3 miR-21-5p 靶基因GO 分析結(jié)果

在生物過程中miR-21-5p 靶基因主要富集于細胞大分子代謝過程、細胞代謝過程的調(diào)節(jié)等。見圖1。在細胞組成層面，miR-21-5p 靶基因主要富集于細胞內(nèi)細胞器、細胞質(zhì)、細胞內(nèi)膜結(jié)合細胞器等GO 條目中。見圖2。在分子功能層面，靶基因主要富集于蛋白質(zhì)、DNA、酶聚集等GO 條目中。見圖3。

圖1 miR-21-5p 靶基因的 GO-生物過程氣泡圖

圖2 minR-21-5p 預測靶基因的 GO-細胞組成氣泡圖

圖3 miR-21-5p 靶基因的 GO-分子功能分析圖

2.4 miR-21-5p 靶基因集KEGG 通路分析結(jié)果

KEGG 分析發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集于以下生物學通路中，分別為癌癥相關(guān)通路、MAPK 信號通路、TGF-β 通路等。見圖4。

圖4 miR-21-5p 靶基因 KEGG 氣泡圖

3 討論

口腔黏膜下纖維化是一種慢性隱匿性癌前病變[5-6]，主要病理過程為成纖維細胞增生、膠原堆積，臨床表現(xiàn)為口干、進食灼熱感、張口受限等不適[7]。流行病學調(diào)查表明口腔黏膜下纖維化發(fā)病與咀嚼檳榔有關(guān)[8]。隨著全世界咀嚼檳榔人數(shù)逐漸增多，口腔黏膜下纖維化發(fā)病率日漸上升，口腔黏膜下纖維化癌變率也逐漸增加[9]。因此，研究口腔黏膜下纖維化癌變的發(fā)生機制，尋找有效治療方法具有重大意義。

miR-21 作為一種癌基因，已經(jīng)被證實在多種腫瘤組織中高表達。miR-21 在口腔鱗癌中的表達比口腔黏膜下纖維化更高，且其表達量與臨床分期相關(guān)[3,10]。最近一項研究表明，循環(huán)miR-21 可作為檢測口腔癌的潛在生物標志物[11]。miR-21 與纖維化密切相關(guān)[12]，研究發(fā)現(xiàn)miR-21 在口腔黏膜下纖維化組織中的表達上調(diào)，且是由TGF-β 通路介導的[4]。本研究結(jié)果顯示，口腔黏膜下纖維化癌變細胞中的miR-21-5p 表達量明顯高于正常細胞。綜上所述，推測miR-21 可能與口腔黏膜下纖維化癌變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，具體機制尚不清楚。

miR-21 生物信息學分析結(jié)果顯示miR-21-5p靶基因綜合得分排前三的是Smad7、PLAG1、TGF-β1；KEGG 分析發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集于癌癥通路、MAPK信號通路、miRNA 通路與蛋白聚糖通路、TGF-β 通路等。TGF-β 是目前公認最強的致纖維化因子[13]，與纖維化及癌變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。在口腔黏膜下纖維化的發(fā)病機制中TGF-β 起主要作用，表現(xiàn)為3 種亞型及其受體mRNA 表達的增加[15]。在口腔黏膜下纖維化癌變組織和細胞中，其表達高于正常組織和細胞，并且與腫瘤的惡性程度和預后相關(guān)[16-17]。TGF-β信號介導與纖維化相關(guān)的miRNA 的表達，上調(diào)的miRNA 包括miR-21[18-19]。TGF-β 信號通路和miRNA通路顯示出相互串話，Smad7 很可能就是介導串話的中間信號[18]。研究表明，沉默miR-21 可通過抑制TGF-β1/Smad7 信號通路減輕肝實質(zhì)纖維化[20-24]，miR-21 調(diào)控TGF-β/Smad7 信號通路介導心肌梗死后纖維化[25]，miR-21/Smad7 信號決定TGF-β1 誘導的癌相關(guān)成纖維細胞形成[26]。Smad7 在口腔黏膜下纖維化和口腔鱗癌中的表達均顯著上調(diào)并促進其發(fā)生發(fā)展[27]。

綜合以上，本研究推測miR-21-5p 與口腔黏膜下纖維化癌變密切相關(guān)，且Smad7 可能串話miR-21-5p 與TGF-β 介導口腔黏膜下纖維化癌變。