賈夢(mèng)雪， 王嘉維， 賀 新， 李其發(fā)， 張冬梅， 孫藝平， 劉克敏， 傅 雷

(大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044)

茶色素(tea pigment，TP)有“綠色黃金”之稱，是茶葉中茶多酚經(jīng)過氧化聚合反應(yīng)衍生出的一種聚合物，具有天然、低毒和高特效性等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)抗心腦血管疾病七大危險(xiǎn)因子(年齡超過45歲男性，55歲以上女性或停經(jīng)者；有心臟病或中風(fēng)或猝死病家族史；高血壓；高血脂；糖尿??；吸煙；肥胖或少運(yùn)動(dòng))。因茶色素與茶多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)有高度同源性，故其具有同茶多酚一樣的增強(qiáng)免疫力、抗菌、抗病毒和抗氧化等多種藥理功能，且基本無毒副作用[1]。鎂是人體中重要的宏量元素之一，在正常人體內(nèi)含量在陽離子中排第四位，僅次于鈣、鈉、鉀。其中約95%左右的鎂分布在細(xì)胞內(nèi)，其含量僅次于鉀。鎂離子濃度是否穩(wěn)定與機(jī)體正常的生理代謝過程密切相關(guān)。高鎂血癥(血清鎂濃度>1.2 mmol/L)可對(duì)神經(jīng)-肌肉、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、平滑肌等產(chǎn)生影響，同時(shí)高鎂還常會(huì)引起低鈣和高鉀，影響機(jī)體的電解質(zhì)平衡[2]，進(jìn)而對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生一定的損傷作用。本實(shí)驗(yàn)室前期相關(guān)研究結(jié)果顯示，TP在鈣、鉀離子濃度異常時(shí)對(duì)離體蟾蜍心臟具有一定保護(hù)作用[3，4]，但對(duì)鎂離子異常時(shí)的影響結(jié)果未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探尋TP在高鎂濃度異常條件下對(duì)離體蟾蜍心臟的保護(hù)作用，為保障臨床合理性用藥提供安全指標(biāo)。本研究已通過大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為AEE21026。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

72只中華蟾蜍雌雄兼有，體質(zhì)量(90±10) g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(遼)2018-0002，選擇北方的秋季開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及制備

依照標(biāo)準(zhǔn)配方配制任氏液試劑，MgCl2、CaCl2、NaCl等均為優(yōu)質(zhì)純?cè)噭? mL蒸餾水中溶入10 mg TP(檢測(cè)TP 純度以游離兒茶素計(jì)36.27%，批號(hào)20150920，江西綠色制藥有限公司)粉末制成10 mg·mL-1茶色素溶液。

1.3 儀器

BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和50 g TP-100張力換能器由成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)。

1.4 方法

1.5 動(dòng)物分組及制備

將72只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組包括正常任氏液組(A組)、高鎂組(B組)和TP組(C組)。A組的離體蟾蜍心臟標(biāo)本只灌流正常任氏液，B組根據(jù)改灌流MgCl2劑量不同分為A+B1組和A+B2組，即離體蟾蜍心臟標(biāo)本中需要先灌流正常任氏液，然后再分別改灌流含4 mg·mL-1或8 mg·mL-1的MgCl2任氏液。C組根據(jù)灌流TP劑量的不同分為A+C1組和A+C2組，即離體蟾蜍心臟標(biāo)本中需要先灌流正常任氏液，然后再分別改灌流含200 μg·mL-1和400 μg·mL-1的TP任氏液；實(shí)驗(yàn)組包括 B1+C1組、B1+C2組、B2+C1組和B2+C2組，如4 mg·mL-1高鎂任氏液 + 200 μg·mL-1TP組(B1+C1組)是在離體蟾蜍心臟標(biāo)本中灌流4 mg·mL-1MgCl2任氏液后，改灌流200 μg·mL-1TP任氏液,其余各組與此進(jìn)行類似操作，每組8只。

1.5.1 模型制備 根據(jù)參考文獻(xiàn)制備離體蟾蜍心臟標(biāo)本，取1只蟾蜍搗毀腦和脊髓，仰臥位固定于蛙板上，打開心腔暴露心臟。在主動(dòng)脈干下穿2根線，在主動(dòng)脈球上端剪口，將盛滿任氏液的玻璃蛙心插管插向心室，一根線用于插管結(jié)扎固定，另一根線遠(yuǎn)離蟾蜍靜脈竇結(jié)扎其余的動(dòng)靜脈[5]。將心臟及靜脈竇一起剪下，觀察到蛙心插管內(nèi)血液隨著心臟的收縮而上下波動(dòng)明顯后，用任氏液沖洗4～6次，最后在心室收縮末期固定蛙心插管內(nèi)的任氏液為1.0 mL。

1.5.2 檢測(cè)指標(biāo) 依據(jù)參考文獻(xiàn)采用計(jì)算機(jī)和BL-420 S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄離體蟾蜍心臟標(biāo)本的心肌收縮曲線和心率[6]。同時(shí)依照史為清等[7]方法將兩電極分別置于離體蟾蜍心房和心室肌來記錄40 min內(nèi)的心電圖變化。

1.5.3 給藥方法 采用蟾蜍心室外加藥的方法，通過心室的收縮波動(dòng)使心室吸收藥物。每次加入一定量溶液前都需要先取出等量的灌流液，從而保證心室外容積的固定，加入不同劑量的MgCl2或TP溶液后需要記錄30～40 min內(nèi)的心搏曲線。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TP在正常任氏液條件下對(duì)離體蟾蜍心臟的心肌收縮力和心率的影響

表1示，在相對(duì)適宜條件下，正常任氏液組的離體蟾蜍心臟標(biāo)本2 h內(nèi)心肌收縮力和心率均無明顯變化。待正常任氏液離體蟾蜍心臟標(biāo)本穩(wěn)定后，改灌流200 μg· mL-1TP溶液，換液前后的心肌收縮力和心率均沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在正常任氏液條件下，當(dāng)心室外的TP劑量為400 μg·mL-1時(shí)，離體蟾蜍心臟標(biāo)本的心肌收縮力增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而心率無變化且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 TP在正常任氏液條件下對(duì)離體蟾蜍心肌收縮力與心率影響比較

2.2 高鎂在正常任氏液條件下對(duì)離體蟾蜍心肌收縮力和心率的影響

表2示，待正常任氏液蟾蜍心臟標(biāo)本穩(wěn)定后，分別改灌流4 mg·mL-1和8 mg·mL-1MgCl2溶液，換液前后蟾蜍心臟標(biāo)本的心肌收縮力均減弱，心率均減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

2.3 TP在高鎂任氏液條件下對(duì)離體蟾蜍心臟心肌收縮力和心率的影響

表2示，待高鎂任氏液蟾蜍心臟標(biāo)本穩(wěn)定后，分別改灌流200 μg·mL-1和400 μg·mL-1的TP溶液，與4 mg·mL-1MgCl2任氏液組比較，高鎂TP組的心肌收縮力和心率均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且TP劑量越大，心肌收縮力相對(duì)于4 mg·mL-1MgCl2任氏液組增大越多，但心率隨TP劑量增大稍減小，但仍高于4 mg·mL-1MgCl2任氏液組心率。與8 mg·mL-1MgCl2任氏液組比較，高鎂TP任氏液組心肌收縮力和心率均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。且隨TP劑量的增大而增高，但仍低于正常任氏液組。

表2 高鎂任氏液條件下各組離體蟾蜍心臟心肌收縮力與心率比較

2.4 心電圖結(jié)果

圖1示，離體蟾蜍心電圖曲線在高鎂任氏液條件下與正常任氏液條件下比較可以看到明顯的P-R間期延長，QRS波群變小、增寬。在高鎂任氏液中加入TP后，心電圖曲線恢復(fù)到近似正常任氏液組水平。不同劑量高鎂和TP對(duì)離體蟾蜍心臟的心電圖結(jié)果無明顯影響。

圖1 3種條件下離體蟾蜍心臟的心電圖曲線

3 討論

早期研究表明，TP具備調(diào)節(jié)血脂、抗氧化和抗多種心腦血管疾病等多種藥理作用。主要是因?yàn)門P對(duì)心血管系統(tǒng)細(xì)胞有強(qiáng)有力的保護(hù)和修復(fù)作用,并具有調(diào)節(jié)人體免疫力、抗菌抗病毒等多種藥理活性,同時(shí)也在各種相關(guān)疾病的控制和預(yù)防中有一定療效[8]。通過此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，在高鎂條件下，離體蟾蜍的心臟功能可以發(fā)生明顯下降，但是當(dāng)改灌流不同劑量的TP后，離體蟾蜍的心臟功能可見不同程度恢復(fù)，這種現(xiàn)象說明較低劑量的TP對(duì)高鎂已經(jīng)出現(xiàn)了一定的治療作用，但是劑量尚不足以使其完全恢復(fù)正常；而高劑量TP就出現(xiàn)了明顯治療作用，可使離體蟾蜍心臟功能基本恢復(fù)正常。

鎂離子是機(jī)體中一種必不可少的陽離子,對(duì)機(jī)體內(nèi)許多陽離子通道有重要調(diào)節(jié)作用。高鎂使離體蟾蜍心肌收縮力顯著降低的機(jī)制，可能是Mg2+通過對(duì)Ca2+的天然拮抗作用,抑制電壓依賴性鈣通道的開放[9],通過增強(qiáng)Mg2+-Na+交換抑制Ca2+-Na+交換,從而減少Ca2+的跨膜內(nèi)流,還增強(qiáng)了細(xì)胞膜和肌漿網(wǎng)上鈣泵的活性,進(jìn)一步促進(jìn)Ca2+的排出和攝取[10]。除此之外，Mg2+是300多種酶的輔助因子，Mg2+可通過興奮心肌細(xì)胞線粒體的氧化磷酸化，影響細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和心肌環(huán)化腺苷酶的激活等途徑，擾亂心肌的正常功能[11]。當(dāng)細(xì)胞外Mg2+增加時(shí)，可使靜息電位升高，動(dòng)作電位上升速度變快，幅度加大，時(shí)程延長，使心肌細(xì)胞興奮性和自律性降低，表現(xiàn)為自律性細(xì)胞的抑制，出現(xiàn)竇性心動(dòng)過緩以及各種情況的傳導(dǎo)阻滯。故而心電圖結(jié)果顯示，P-R間期延長，QRS波群變小增寬。而高血鎂癥常伴有高鉀血癥，故可見高尖的T波[2]。加入茶色素后，離體蟾蜍心臟的心肌收縮力、心率以及心電圖曲線均有所恢復(fù)。汪洋[12]、董帥[13]等相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，TP可通過降低心肌細(xì)胞對(duì)K+的通透性以及增強(qiáng)Ca2+的通透性，以減輕高鎂對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用，使心肌膜電位趨于正常，心肌收縮力逐漸恢復(fù)，進(jìn)而起到保護(hù)離體蟾蜍心臟功能的作用。同時(shí)仍有研究表明，TP的抗氧化和抗自由基產(chǎn)生作用對(duì)心肌細(xì)胞也具有保護(hù)作用[14]。上述結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，因此推測(cè)TP在高鎂條件下的心肌保護(hù)作用可能也與鈣、鉀離子通道等有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)研究僅觀察到TP高鎂條件下對(duì)離體蟾蜍的心臟保護(hù)作用，其更微觀細(xì)致的作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步的研究。

高鎂血癥除少數(shù)醫(yī)源性因素導(dǎo)致體內(nèi)鎂含量過多外，大多數(shù)是因?yàn)槟I臟的排泄功能障礙引起。因早期臨床表現(xiàn)缺乏特異性容易被忽視，到后期再進(jìn)行治療就會(huì)更加困難，從而導(dǎo)致預(yù)后不良。由本次實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果推斷，利用TP治療高鎂血癥可能會(huì)顯著降低Mg2+對(duì)心肌細(xì)胞的損傷作用，增強(qiáng)心肌的抵抗力。因TP具有明顯的心肌保護(hù)作用，預(yù)計(jì)可以明顯改善高鎂血癥患者的治療效果以及臨床預(yù)后。