鄭向江 趙澤娟 滿 意 霍孟田 楊 萍

（山東省腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，臨沂大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 臨沂 276005）

近年來(lái)，暗場(chǎng)光散射技術(shù)極大地吸引了人們的興趣，被廣泛應(yīng)用于探測(cè)化學(xué)反應(yīng)[1-2]，實(shí)時(shí)光學(xué)傳感[3]，金屬離子的高靈敏度定量[4]，單細(xì)胞水平的成像等[5]領(lǐng)域。暗場(chǎng)光散射技術(shù)主要基于等離子探針的局域表面共振效應(yīng)的原理（如圖1），利用暗視野顯微鏡（Dark field microscope,DFM）能夠有效地捕捉探針的散射光信息，一方面靶引發(fā)納米顆粒的聚集，引起散射光顏色的改變，可以對(duì)特征光點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，建立起與靶標(biāo)濃度相關(guān)的工作曲線，用來(lái)對(duì)腫瘤標(biāo)志物靶標(biāo)進(jìn)行定量檢測(cè)；另一方面與靶標(biāo)相關(guān)的納米顆粒微環(huán)境的改變，會(huì)影響散射光譜的變化，特別是強(qiáng)度的改變和峰位置的偏移。分析腫瘤標(biāo)志物靶標(biāo)與散射光譜變化的關(guān)系，也可以達(dá)到檢測(cè)靶標(biāo)的目的。[6-8]暗場(chǎng)光散射技術(shù)具有非常突出的優(yōu)點(diǎn)：暗場(chǎng)光散射成像無(wú)背景干擾，靶標(biāo)的細(xì)微結(jié)構(gòu)可以突出顯示在成像中，適合顆粒、細(xì)胞等小尺度界面的觀測(cè)；常用的探針主要是貴金屬納米顆粒，光學(xué)性質(zhì)非常優(yōu)良，所處環(huán)境的輕微改變都能引起等離子光譜強(qiáng)度或者峰位置的改變，有利于對(duì)靶標(biāo)的分析檢測(cè)。

圖1 暗場(chǎng)散射成像技術(shù)原理圖Fig.1 Schematic diagram of dark field light scattering technology[6]

腫瘤標(biāo)志物是一類能夠反映腫瘤的存在和生長(zhǎng)的物質(zhì)，是由腫瘤細(xì)胞或者腫瘤組織表達(dá)合成的，或是機(jī)體在腫瘤發(fā)生和增殖過程中對(duì)腫瘤反應(yīng)增加的物質(zhì)。高特異性、高靈敏度檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物是實(shí)現(xiàn)腫瘤早期診斷的重要手段。本文主要研究暗場(chǎng)光散射技術(shù)在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用，特別是檢測(cè)脫氧核糖核酸（DNA）、微小核糖核酸（miRNA）、甲胎蛋白、癌胚抗原等腫瘤標(biāo)志物，并對(duì)基于暗場(chǎng)光散射技術(shù)的檢測(cè)方法的下一步發(fā)展進(jìn)行展望。

1 暗場(chǎng)光散射技術(shù)在DNA檢測(cè)中的應(yīng)用

DNA是生物體內(nèi)一類攜帶遺傳信息的生物大分子。四種不同堿基的排布序列使DNA成為遺傳信息的載體，來(lái)指導(dǎo)合成生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)。Bu等人通過兩條互補(bǔ)的DNA單鏈，誘導(dǎo)膠體金的聚集沉淀，通過暗場(chǎng)顯微鏡成像來(lái)定量DNA，檢測(cè)限為100 fM。[9]Guo等人設(shè)計(jì)了一種Y型DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的比色傳感器，誘導(dǎo)膠體金二聚物的形成，可以控制粒子間的距離和粒子聚集的尺寸，大大提高了穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)的比色方法相比，檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍增加了2個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)限增加了10000倍。[10]在此工作基礎(chǔ)上，Li等改進(jìn)了Y型結(jié)構(gòu)的比色傳感器設(shè)計(jì)，用低成本的單鏈DNA代替昂貴的2-硫乙醚乙酸在材料表面形成致密層，用來(lái)不對(duì)稱修飾其他的單鏈DNA以形成Y型結(jié)構(gòu)傳感器，引發(fā)膠體金二聚體的形成（如圖2）。[11]在暗場(chǎng)顯微鏡下，使用金納米顆粒計(jì)數(shù)法對(duì)靶DNA進(jìn)行定量，檢測(cè)限為43 aM，其靈敏度比傳統(tǒng)比色方法大大提高。同樣采用膠體金計(jì)數(shù)法，Li等人設(shè)計(jì)了一種非放大三明治方法對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合磁分離技術(shù)，檢測(cè)限甚至可以達(dá)到10-15 M。[12]Chen等人設(shè)計(jì)了一種新的比色方法，利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成的DNA雙鏈引發(fā)膠體金的聚集，利用暗場(chǎng)顯微鏡計(jì)數(shù)定量檢測(cè)靶DNA。[13]

圖2 基于Y型結(jié)構(gòu)探針設(shè)計(jì)暗場(chǎng)檢測(cè)DNAFig.2 Detection of DNA based on Y-typestructure probe[11]

2 暗場(chǎng)光散射技術(shù)在miRNA檢測(cè)中的應(yīng)用

微小核糖核酸（miRNA）是一類長(zhǎng)度約19-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA。研究表明，miRNA在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中的表達(dá)存在著明顯的差異，大部分的miRNA基因位于與腫瘤形成相關(guān)的基因位點(diǎn)上，由此表明miRNA可能在腫瘤的發(fā)生或者生長(zhǎng)階段發(fā)揮關(guān)鍵作用。比如：miR-21在胃癌等惡性腫瘤中表達(dá)豐富；miR-17-92在小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)過程中起關(guān)鍵的作用；miR-122a常見于正常的肝臟組織中，但是在肝癌中的表達(dá)明顯降低等。

Hwu等人發(fā)展了一種基于暗場(chǎng)微井的方法來(lái)檢測(cè)緩沖溶液和細(xì)胞裂解液中的miRNA，高通量傳感，能夠即時(shí)檢測(cè)。[14]Xu等人發(fā)展了一種基于催化發(fā)卡組裝、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和金—銀納米探針刻蝕的高靈敏度方法來(lái)檢測(cè)miRNA-141。miRNA-141能夠引發(fā)催化發(fā)卡組裝和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，促使模擬辣根過氧化物酶的形成，能夠使雙氧水分解為羥基自由基，來(lái)刻蝕金納米顆粒的銀殼。由此產(chǎn)生的表面等離子體吸附和散射效應(yīng)可以用于miRNA-141的定量依據(jù)，檢測(cè)限低至50 aM。[15]Zhou等人發(fā)展了一種新的顏色分析方法來(lái)區(qū)分單個(gè)金納米顆粒，極大地改進(jìn)了圖像的顏色分辨率和檢測(cè)的靈敏度，用來(lái)檢測(cè)與肝腫瘤細(xì)胞相關(guān)的miRNA。[16]Long等人設(shè)計(jì)了一個(gè)單細(xì)胞中同時(shí)進(jìn)行miRNA-21靶向成像和光熱治療的體系。如圖3，miRNA-21誘導(dǎo)金納米顆粒聚集，在暗場(chǎng)顯微鏡下成像，并且吸收峰移至近紅外光區(qū)。近紅外光照射殺死MCF-7癌細(xì)胞。[17]

圖3 (a)miRNA-21誘導(dǎo)金納米顆粒聚集和熒光開關(guān)；（b）miRNA-21原位成像和miRNA靶向近紅外治療

3 暗場(chǎng)光散射技術(shù)在蛋白類標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用

常見的屬于蛋白類的腫瘤標(biāo)志物有癌胚抗原、核仁素、甲胎蛋白、堿性磷酸酶、p53蛋白等。

癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是一種適用范圍廣泛的腫瘤標(biāo)志物，主要位于內(nèi)胚層分化的惡性腫瘤細(xì)胞表面。CEA雖然不能作為腫瘤診斷的特征參數(shù)，但具有較高的臨床意義。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)是一種單一的糖蛋白，在正常情況下由胎兒的卵黃囊及肝細(xì)胞合成。一般情況下，正常人的甲胎蛋白值不會(huì)升高，但肝癌患者的甲胎蛋白值往往是顯著升高的，所以臨床上常用AFP來(lái)進(jìn)行肝癌的早期篩查。前列腺特異抗原（prostate specific antigen，PSA）是前列腺上皮細(xì)胞分泌的一種蛋白。正常人血清中含量極微。在腫瘤或者炎癥的情況下，前列腺的結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致血液中的PSA升高，可用于前列腺癌的診療監(jiān)測(cè)。

Ma等人基于三明治免疫分析方法，設(shè)計(jì)了兩種納米探針，同時(shí)對(duì)AFP和CEA進(jìn)行暗視野成像（如圖4）。AFP抗體結(jié)合的金納米顆粒和CEA結(jié)合的銀納米顆粒在暗視野顯微鏡下顯示不同的顏色，因此可以利用計(jì)數(shù)法對(duì)AFP和CEA進(jìn)行同時(shí)定量。分析表明，兩種靶標(biāo)在一定濃度范圍內(nèi)（0.5-10 ng/mL）相互沒有干擾，表明了雙靶同時(shí)靈敏檢測(cè)的實(shí)用性[18]。Poon等基于貴金屬納米粒子間的等離子體耦合效應(yīng)，設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單而有效的腫瘤標(biāo)志物定量檢測(cè)的方法。[19]將金納米顆粒和銀納米顆粒作為捕獲探針和信號(hào)探針，分別修飾了一級(jí)抗體和二級(jí)抗體。在相應(yīng)靶存在下，能夠形成夾心結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物，大大增強(qiáng)了散射強(qiáng)度。用暗場(chǎng)顯微鏡光譜系統(tǒng)測(cè)定粒子的強(qiáng)度變化，來(lái)確定腫瘤標(biāo)志物的濃度。測(cè)定了三種類型的標(biāo)志物，包括CEA、AFP和PSA，測(cè)定的檢測(cè)限分別為7.0 pM、3.3 pM和5.9 pM，0到300 pM范圍內(nèi)存在線性關(guān)系。與傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比，呈現(xiàn)了較好的一致性。Wu等人也發(fā)展了一種檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物的方法。設(shè)計(jì)使用鏈霉親合素功能化的磁珠和二抗功能化的金納米顆粒作為低成本和通用的免疫平臺(tái)。PSA、CEA和AFP的檢測(cè)限分別為1.0、5.0和1.0 ng/mL。[20]

圖4 在DFM下同時(shí)測(cè)定AFP和CEA的原理圖Fig.4 Schematic diagram of simultaneousdetermination of AFPand CEA[18]

核仁素(nucleolin，NCL)是在核仁中高度表達(dá)的一種蛋白，參與很多生物學(xué)過程，并能夠與多種致癌基因作用，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖等。核仁素作為一種腫瘤標(biāo)志物，能夠在多種癌細(xì)胞表面選擇性表達(dá)，可以作為脂蛋白、細(xì)胞因子等的受體。因此，對(duì)核仁素進(jìn)行靶向和成像，是一種診斷惡性腫瘤的重要手段。Liu等人利用硒納米顆粒，設(shè)計(jì)了一種新型散射納米探針，將適配體修飾到硒納米顆粒上，能夠精確靶向核仁素高表達(dá)的Hep-2細(xì)胞，進(jìn)行暗視野成像（如圖5）。[21]

圖5 應(yīng)用核仁素適體-硒納米顆粒進(jìn)行暗場(chǎng)成像Fig.5 Dark field imaging of nucleolin aptamer-selenium nanoparticles[21]

腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是一種主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的能夠抑制或者殺傷腫瘤的細(xì)胞因子，能夠造成腫瘤組織的出血性壞死。TNF-α的檢測(cè)，對(duì)于判斷體內(nèi)是否有腫瘤有很好的幫助。Ju等人利用3D加強(qiáng)的暗場(chǎng)超分辨顯微鏡和雙編碼等離子納米傳感方法檢測(cè)TNF-α。[22]TNF-α可以在單分子水平上進(jìn)行免疫靶向，而且通過測(cè)定陣列芯片上的散射信號(hào)進(jìn)行定量分析。該方法檢測(cè)限為65 zM(1.14 ag/mL)，線性范圍為65 zM-2.08 pM(1.14 ag/mL-36.4 pg/mL)。人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human growth factor receptor-2，HER2）是一種存在于乳腺癌細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)，不但是乳腺癌診斷及臨床治療檢測(cè)的重要的標(biāo)志物，而且是靶向藥物治療乳腺癌的一個(gè)重要靶點(diǎn)。Guo等人設(shè)計(jì)了點(diǎn)擊反應(yīng)促使修飾有HER2的適體的金納米粒子聚集，并使細(xì)胞表面的HER2蛋白原位暗場(chǎng)成像。[23]癌抗原125（CA125）是一種存在于卵巢腫瘤的上皮細(xì)胞內(nèi)的糖蛋白，通常作為卵巢上皮癌的腫瘤標(biāo)志物。Ju等人利用雙模式暗場(chǎng)顯微鏡檢測(cè)CA125。[24]膠體銀標(biāo)記的CA125在金納米點(diǎn)上進(jìn)行免疫反應(yīng)，基于暗場(chǎng)圖像，數(shù)字相機(jī)和EMCCD分別進(jìn)行定性和定量分析，發(fā)展的免疫傳感器展示了低的檢測(cè)限（4 U/mL）和寬的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)范圍（4 U/mL-80 U/mL）。

p53蛋白是一種腫瘤抑制蛋白。野生型p53蛋白（WTp53)含有中心特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠綁定一個(gè)共識(shí)位點(diǎn)的雙鏈DNA。在大多數(shù)類型的癌細(xì)胞中，p53基因的廣泛變異導(dǎo)致其中心DNA結(jié)合域發(fā)生變化，失去與DNA的結(jié)合能力。突變型p53蛋白(MUp53)的異常表達(dá)已被認(rèn)為是致癌的重要刺激作用。因此，檢測(cè)和區(qū)分WTp53和MUp53對(duì)于癌癥的診斷具有重要意義。Qian等設(shè)計(jì)了一種雙靶向納米囊泡用于細(xì)胞內(nèi)WTp53和MUp53的原位成像。[25]囊泡包覆的等離子金納米粒子用DNA雙鏈功能化，熒光素標(biāo)記的MUp53抗體偶聯(lián)到納米囊泡的表面。進(jìn)入細(xì)胞以后，釋放的金納米離子通過識(shí)別WTp53和雙鏈DNA團(tuán)聚?？梢杂冒狄曇帮@微鏡觀察納米探針的顏色變化，定性描述細(xì)胞內(nèi)WTp53蛋白的分布情況，通過熒光素標(biāo)記的MUp53抗體和MUp53免疫識(shí)別，進(jìn)行MUp53的定位。這樣通過一步孵育的方法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)WTp53和MUp53的原位成像。

4 暗場(chǎng)光散射技術(shù)在胞外囊泡檢測(cè)中的應(yīng)用

胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs)在大部分生物流體中都大量存在，被認(rèn)為是一類潛在的生物標(biāo)志物。但是大部分的分析都要求分離和純化步驟，耗費(fèi)時(shí)間和人力。Amrollahi等人發(fā)展了一種遠(yuǎn)場(chǎng)納米等離子體加強(qiáng)的散射方法對(duì)EVs進(jìn)行免分離表征。[26]EVs首先被癌癥選擇性抗體進(jìn)行捕獲，然后與偶聯(lián)EVs表面CD9蛋白的抗體的金納米棒進(jìn)行雜交，最后用暗視野顯微鏡進(jìn)行成像并進(jìn)行定量。結(jié)果顯示（如圖6），用暗場(chǎng)光散射技術(shù)檢測(cè)上皮細(xì)胞黏附因子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)與酶聯(lián)免疫測(cè)定相同的效果。通過分析血清樣品中的上皮細(xì)胞黏附因子的表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)早期胰腺導(dǎo)管腺癌患者與健康者的區(qū)分。腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體(tumor-derived exosome，TEX)是細(xì)胞外囊泡其中的一種類型，因其含有蛋白、核酸等多種具有生物學(xué)活性的物質(zhì)，可參與細(xì)胞間的通訊及物質(zhì)交換等過程，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。[27]Wan等人發(fā)展了一種快速檢測(cè)TEX的方法。[28]TEX首先被外泌體特異性抗體捕獲在載玻片表面，再與納米粒子偶聯(lián)的與疾病相關(guān)的抗體探針雜交，靶向的外泌體數(shù)量應(yīng)用暗場(chǎng)顯微鏡成像來(lái)定量。

圖6 用暗視野顯微鏡測(cè)定EpCAM原理圖Fig.6 Schematic diagram of EpCAM detection with DFM[26]

5 結(jié)語(yǔ)

本文研究了利用暗場(chǎng)光散射方法檢測(cè)DNA、miRNA、蛋白類標(biāo)志物及細(xì)胞外囊泡等腫瘤標(biāo)志物的研究進(jìn)展。利用暗場(chǎng)光散射技術(shù)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物具有背景值低、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用范圍廣。但是也存在需要改進(jìn)的地方，比如等離子共振探針目前限于金、銀、硒等材料，需要探索性能更好的材料；單個(gè)顆粒的性質(zhì)研究不夠完善，需要深入機(jī)理研究；大量數(shù)據(jù)處理限于個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，需要借助于大數(shù)據(jù)技術(shù)，快速準(zhǔn)確地提取單顆粒光譜所攜帶的信息；需要發(fā)展更加即時(shí)快捷的檢測(cè)手段，并應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)中；對(duì)細(xì)胞內(nèi)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行的定量研究較少，需要克服遇到的困難，建立新的方法，提升檢測(cè)水平。暗場(chǎng)光散射技術(shù)在腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑＯ嘈烹S著儀器技術(shù)的進(jìn)步和檢測(cè)方法的提升，未來(lái)將會(huì)更加廣泛地應(yīng)用于快速簡(jiǎn)單的臨床檢驗(yàn)，為腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療提供重要的分析手段。