◎ 梁濤波,龍 慧,王 丹,仉 薇,占忠旭,吳 鑫
(1.江西省食品檢驗檢測研究院,江西 南昌 330001;2.南昌市疾病預防控制中心,江西 南昌 330038)
阿膠是一種重要的藥食同源物質(zhì)[1],能用于中藥治療患者,也用于食品領(lǐng)域生產(chǎn)制造各種阿膠制品,如即食阿膠糕、阿膠紅糖茶等。有研究表明,阿膠用于食品生產(chǎn)在加工、運輸和儲存過程中容易受到微生物污染[2-3],尤其是小作坊生產(chǎn)的產(chǎn)品其微生物安全應(yīng)當予以重視[4]。根據(jù)近年來的研究調(diào)查顯示,沙門氏菌在1996—2015年引起166起食物中毒事件,造成8 996人感染[5],金黃色葡萄球菌在2003—2015年引起86起食物中毒事件,造成2 431人感染[6],這兩種致病菌引起的食品微生物污染尤為嚴重。我國食品安全國家標準明確規(guī)定了這兩種病原菌的限量標準,其中沙門氏菌不得檢出,而且一些阿膠制品的企業(yè)標準也有明確規(guī)定。因此,準確檢測阿膠制品中是否攜帶有活的上述致病菌及其數(shù)量,對于及時控制因其導致的感染危害具有重要意義。
目前致病菌活菌檢驗最常用的方法是傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測法,但該方法程序繁雜、耗時長,樣本中可能含有雜菌而產(chǎn)生競爭性抑制,也存在對持留菌、休眠菌及代謝異質(zhì)菌無法成功培養(yǎng)的缺陷,實際操作中可能會發(fā)生漏檢等情況。隨著活菌的快速檢測新技術(shù)不斷出現(xiàn),研究者們將細菌是否具有新陳代謝活性進而產(chǎn)生生物活性物質(zhì),或是否具有完整的細胞結(jié)構(gòu)作為判斷活菌的標準,相繼開發(fā)了ATP生物發(fā)光法、免疫學方法、mRNA檢測法、死菌/活菌熒光染色法、流式細胞術(shù)以及PCR方法等其他活菌檢測方法[7-8]。近年來,也有研究者將PCR與核酸交聯(lián)染料結(jié)合用于致病菌活菌檢測[9],其檢測靈敏度高、特異性強,而且能夠?qū)崿F(xiàn)多重檢測,滿足不同目標菌的同時檢測[10-11]?;诖?,本研究根據(jù)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌特異性基因設(shè)計引物和探針、優(yōu)化反應(yīng)條件,建立多重熒光定量PCR檢測體系,并結(jié)合疊氮溴化丙錠(Propidium Monoazide,PMA)預處理實現(xiàn)活菌檢測。本研究建立的PMA-mqPCR為檢測阿膠制品中活的常見致病菌提供了新參考,對控制阿膠制品的微生物安全具有重要意義。
腦心浸出液和營養(yǎng)瓊脂(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)、Premix Ex Taq?(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)、恒溫水浴鍋(上海智城分析儀器制造有限公司)、高速離心機(賽默飛世爾科技)、恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)和熒光定量PCR儀(伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司,CFX96 Touch)。
本研究選取了10株標準細菌,菌株信息及來源見表1,包含目標菌4株:沙門氏菌(2株),金黃色葡萄球菌(2株);非目標菌6株:大腸埃希氏菌(2株)、銅綠假單胞菌(1株)、蠟樣芽孢桿菌(1株)、糞腸球菌(1株)和克羅諾桿菌(1株)。所有的菌株分別在腦心浸出液和營養(yǎng)瓊脂(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)中進行復蘇和純化培養(yǎng),然后接種在腦心浸出液中獲取菌懸液。取1 mL細菌懸液放置在金屬浴中80 ℃熱處理10 min,得到沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的死菌懸液,并進行平板涂布,確定不存在活菌。
表1 菌株信息及來源表
根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫提供的invA(沙門氏菌)和nuc(金黃色葡萄球菌)序列,使用Beacon designer 8軟件設(shè)計引物和探針,并通過BLAST進行特異性比對,表2為本研究使用的引物和探針序列,引物和探針序列委托通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成。
表2 引物和探針序列表
準備濃度為1 mg·mL-1的PMA溶液,取不同體積的PMA加入濃度為108CFU·mL-1沙門氏菌和金黃色葡萄球死菌和活菌中,使得PMA終濃度為0 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、30 μg·mL-1和40 μg·mL-1,隨后將其放置在暗處室溫孵育5 min,取出放置在冰盒上,并使用500 W鹵素燈在距離樣品管20 cm處曝光5 min,其間每隔30 s進行輕微振動,然后使用1×PBS緩沖液清洗2次,去除多余未交聯(lián)的PMA,最后重懸在200 μL超純水中,并使用水煮法提取基因組DNA[12]。不同濃度PMA處理組獲取的基因組DNA用于qPCR擴增,并通過Ct值確定最佳的PMA濃度。
qPCR反應(yīng)體系為25 μL:12.5 μL Premix Ex Taq?(Takara),0.5~1.0 μL invA-F(10 μmol·L-1)、0.5~1.0 μL invA-R(10 μmol·L-1),0.5~1.0 μL invA-P(10 μmol·L-1),0.5~1.0 μL nuc-F(10 μmol·L-1)、0.5~1.0 μL nuc-R(10 μmol·L-1),0.5~1.0 μL nuc-P(10 μmol·L-1),
DNA模版各2 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min 預變性,95 ℃ 15 s變性,60 ℃ 30 s退火和延伸,40個循環(huán),在退火和延伸階段采集熒光信號。通過梯度qPCR優(yōu)化退火和延伸溫度,溫度范圍設(shè)置為55~65 ℃,并根據(jù)不同溫度對應(yīng)的相對熒光單位(RFU)大小,確定最佳的退火和延伸溫度。
取過夜培養(yǎng)的目標菌株,經(jīng)過PMA預處理后,采用水煮法提取基因組DNA,并使用10倍梯度稀釋法獲取濃度101~108CFU·mL-1的基因組DNA。通過對目標菌基因組DNA進行mqPCR,并根據(jù)擴增結(jié)果以Ct值為縱坐標,細菌濃度為橫坐標建立標準曲線,確定PMA-mqPCR在純培養(yǎng)液中的檢測靈敏度。
通過對阿膠制品進行加標檢測,進一步探究PMA-mqPCR方法檢測實際樣品中沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的可行性。準備25 g阿膠制品加入225 mL 1×PBS緩沖液中制成樣品懸液,并且使用培養(yǎng)法確定樣品懸液不存在沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。制備的加標樣品懸液分別接種沙門氏菌和金黃色葡萄球菌,使其終濃度為107CFU·mL-1,然后進行PMA預處理,并使用水煮法提取基因組DNA。通過10倍梯度稀釋獲取不同濃度的基因組DNA,并進行mqPCR擴增,確定PMA-mqPCR在加標樣中的檢測靈敏度。
選取4株目標菌、6株非目標菌進行純化培養(yǎng),獲取菌懸液,利用水煮法提取基因組DNA,然后對基因組DNA進行qPCR擴增,確定方法的特異性。
準 備500 μL濃 度 為107CFU·mL-1沙 門 氏 菌 和金黃色葡萄球菌活菌懸液,分別加入500 μL細菌濃度為100CFU·mL-1、102CFU·mL-1、104CFU·mL-1、108CFU·mL-1的死菌懸液,制備死活菌混合液,然后進行PMA預處理、基因組DNA提取,最后通過mqPCR擴增,比較各組Ct值評價活菌檢測性能。
PMA濃度是影響活菌檢測的重要條件,合適的濃度能夠最大程度抑制死菌DNA擴增,因此本研究探究了PMA濃度對死菌的抑制效果,優(yōu)化結(jié)果見圖1。根據(jù)圖1a結(jié)果,當PMA濃度從0 μg·mL-1增加到30 μg·mL-1時,死菌處理組的Ct值逐漸升高,30 μg·mL-1增加到40 μg·mL-1的Ct值趨于穩(wěn)定,圖1b金黃色葡萄球菌PMA處理濃度的優(yōu)化結(jié)果與圖1a結(jié)果相似,綜合考慮抑制死菌DNA最佳擴增效果,選取PMA濃度為30 μg·mL-1為最優(yōu)濃度。
圖1 PMA濃度的優(yōu)化結(jié)果圖
反應(yīng)體系的退火溫度是影響qPCR擴增效果的關(guān)鍵因素,合適的退火溫度能夠極大地提高擴增效率和檢測靈敏度,為此本研究優(yōu)化了反應(yīng)體系的退火溫度,結(jié)果如圖2所示。圖2a是invA基因(沙門氏菌)退火溫度優(yōu)化的結(jié)果,當退火溫度從55.0 ℃到57.0 ℃時,相對熒光單位逐漸增加,退火溫度從57.0 ℃到65.0 ℃時,相對熒光單位逐漸降低,圖2b是nuc基因(金黃色葡萄球菌)退火溫度優(yōu)化結(jié)果,綜合考慮invA和nuc基因擴增的退火溫度優(yōu)化結(jié)果,最終選取57.0 ℃為mqPCR的最佳退火溫度。
圖2 退火溫度的優(yōu)化結(jié)果圖
mqPCR體系是多重檢測的基礎(chǔ),為實現(xiàn)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌同時檢測提供了可能,體系建立結(jié)果如圖3所示。通過優(yōu)化引物和探針濃度、退火溫度等反應(yīng)條件,確認多重檢測體系為25 μL,包含:12.5 μL Premix Ex Taq?,0.75 μLinvA-F(10 μmol·L-1)、0.75 μLinvA-R(10 μmol·L-1),0.5 μLinvA-P(10 μmol·L-1),0.5 μLinvA-F(10 μmol·L-1)、0.5 μLinvA-R(10 μmol·L-1),0.5 μLinvA-P(10 μmol·L-1),DNA模版各2 μL,超純水5 μL。反應(yīng)程序為:95 ℃ 5 min預變性,95 ℃ 15 s變性,57 ℃ 30 s退火和延伸,40個循環(huán)。
圖3 多重體系的建立圖
為評價PMA-mqPCR同時檢測沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測性能,本研究對純菌液中的目標菌株進行了檢測,以確定方法的檢測靈敏度。純菌液檢測限結(jié)果見圖4a,其中沙門氏菌的檢測限為102CFU·mL-1,且在102~108CFU·mL-1具有良好的線性相關(guān)性(R2=0.997 5),標準曲線為y=-3.09x+42.83;金黃色葡萄球菌的檢測限為101CFU·mL-1,且在101~108CFU·mL-1具 有 良 好 的 線 性 相 關(guān) 性(R2=0.997 2),標準曲線為y=-3.076x+39.38。
為評價PMA-mqPCR檢測實際樣品的能力,本研究對阿膠制品進行加標檢測,以確定該方法的實際應(yīng)用效果。人工加標檢測結(jié)果見圖4b,其中沙門氏菌的檢測限為103CFU·mL-1,且在103~107CFU·mL-1具有良好的線性相關(guān)性(R2=0.998 6),標準曲線為y=-2.977x+42.86;金黃色葡萄球菌的檢測限為103CFU·mL-1,且 在103~107CFU·mL-1具 有良好的線性相關(guān)性,(R2=0.998 8),標準曲線為y=-3.468x+48.43。
圖4 檢測限評價結(jié)果圖
為評價PMA-mqPCR檢測不同細菌的選擇性,本研究選取了4株目標菌株,6株非目標菌進行特異性驗證。特異性結(jié)果如表1所示,其中invA基因只能擴增沙門氏菌基因組DNA,非目標菌無陽性結(jié)果,nuc基因只能擴增金黃色葡萄球菌基因組DNA,非目標菌無陽性結(jié)果。結(jié)果表明,本研究建立的PMA-mqPCR具有良好的特異性,能夠準確地同時檢測沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。
為探究PMA用于活菌檢測的效果,本研究分別在107CFU·mL-1活菌液中加入等體積的100CFU·mL-1、104CFU·mL-1、106CFU·mL-1和108CFU·mL-1死菌液?;罹鷻z測結(jié)果如圖5所示,各組Ct值基本持平,其中沙門氏菌活菌回收率為95.70%(104CFU·mL-1)、96.53%(106CFU·mL-1)、105.62%(108CFU·mL-1),金黃色葡萄球菌的回收率分別為100.60%(104CFU·mL-1)、97.63%(106CFU·mL-1)、96.74%(108CFU·mL-1),綜合考慮各組Ct值以及回收率,表明本研究建立的PMA-mqPCR具有較好的活菌檢測效果。
圖5 活菌檢測效果圖
本研究根據(jù)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性基因設(shè)計引物和探針,結(jié)合PMA預處理,建立多重熒光PCR活菌檢測體系,在最優(yōu)條件下,PMA-mqPCR用于純菌液中沙門氏菌的檢測限為102CFU·mL-1,金黃色葡萄球菌的檢測限為101CFU·mL-1,阿膠制品加標樣的檢測限均為103CFU·mL-1。通過PMA預處理,結(jié)合多重熒光檢測體系,能夠?qū)崿F(xiàn)同時對多種致病菌活菌檢測,而且活菌回收率高。
目前致病菌活菌檢測技術(shù)應(yīng)用最廣泛、最簡單的是傳統(tǒng)培養(yǎng)法,通過一系列的增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定實現(xiàn)活菌檢測,但這種方法不光費時費力,而且對一些處于非可培養(yǎng)狀態(tài)的細菌無法鑒定[13]。本研究根據(jù)死活菌細胞膜的完整度不同,利用核酸交聯(lián)染料PMA無法進入細胞膜完整的活細菌,死菌細胞膜不完整使得PMA能夠跨過細胞膜與細菌基因組DNA發(fā)生不可逆結(jié)合[14],通過提取細菌基因組DNA用于qPCR擴增,死菌基因組DNA無法成功變性使其不能延伸,而活菌DNA不受影響,實現(xiàn)活菌檢測。
熒光定量PCR用于致病菌檢測,靶基因的選擇及引物和探針設(shè)計直接關(guān)系到檢測體系的特異性和靈敏度,選擇合適的靶基因和設(shè)計適用于多重檢測引物和探針至關(guān)重要。本研究分別選取沙門氏菌invA基因和金黃色葡萄球菌nuc基因為靶基因,其中invA基因編碼沙門氏菌III分泌系統(tǒng)InvA蛋白[15]、nuc基因編碼金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶[16],并且有研究報道invA[17]和nuc[18]分別是沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的特異性基因。本研究通過Beacon designer軟件設(shè)計引物和探針,結(jié)果顯示引物和探針的Tm值均符合多重熒光定量PCR設(shè)計標準,并且多重檢測體系的建立也進一步證明引物和探針設(shè)計的合理性,為實現(xiàn)沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的同時檢測奠定基礎(chǔ)。